Патент на изобретение №2399674

(54) СПОСОБ 11 БЕТА-ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ДЕЛЬТА4-3-КЕТОСТЕРОИДОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу 11-гидроксилирования ⁴-3-кетостероидов с помощью биомассы мицелия штамма Curvularia lunata ВКПМ F-988. Для трансформации используют отмытый от питательной среды мицелий штамма Curvularia lunata ВКПМ F-988, возраст которого не превышает 30 ч. Мицелий берут в количестве, при котором отношение биомассы к трансформируемому стероиду составляет 1.5-2.5:1. Трансформацию ведут в буферном растворе, а стероидный субстрат вносят в виде суспензии микрокристаллов, либо в виде водорастворимого комплекса с метил--циклодекстрином, отношение стероида к которому составляет 1:1-0,6:1 (моль/моль). 11-Гидроксипроизводные получают с выходом 50-80%. Предлагаемое изобретение позволяет повысить селективность процесса 11-гидроксилирования, концентрацию трансформируемого стероидного субстрата до 20 г/л и сократить период реакции до 24-50 час. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской химии, микробиологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения биологически активных стероидных соединений, содержащих 11-гидроксигруппу, которая отвечает за наличие в молекуле противовоспалительной активности.

11-Гидроксилирование стероидов рассматривается как одна из наиболее значимых реакций в ряду стероидных биотрансформаций, т.к. служит для получения глюкокортикоидов противовоспалительного и антиаллергического действия, таких как гидрокортизон, преднизолон, а также фторированных кортикостероидов (триамцинолон, дексаметазон и др) в промышленном масштабе [1].

Максимальное количество способов 11-гидроксилирования ⁴-3-стероидов являются способами получения гидрокортизона (С₂₁О₅Н₃₀, кортизол, вещество «F» Кендалла, прегн-4-ен-11,17,21-триол-3,20-дион) – представителя важного класса лекарственных препаратов стероидной природы [2-25]. В качестве самостоятельного препарата/гидрокортизон используется для лечения артритов, бурсита, воспалительных и аллергических заболеваний кожи и др. Он также служит в качестве исходного субстрата в синтезе других кортикоидов – кортизона, преднизолона, преднизона, метилпреднизолона [2]. Еще 11-гидроксилирование необходимо для получения дексаметазона по схеме через 16-метилкортексолон.

Представляют также интерес как соединения с высокой физиологической активностью и другие 11-гидроксипроизводные ⁴-3-кетостероидов [22-28]. 11-Гидроксистероиды получают введением 11-гидроксильной группы в стероидную молекулу с помощью микроорганизмов – низших грибов. Однако в отличие от 11-гидроксилирования, которое осуществляют более 300 видов микроорганизмов, способность к накоплению 11-гидроксистероидов с удовлетворительным выходом, но в смеси с 11-гидроксипродуктами, присуща ограниченному числу видов грибов – Absidia orchidis, Cunninghamella blakesleeana, C.elegans, Cochliobolus lunatus [2, 6, 13, 16, 20, 28]. И только штаммы Curvularia lunata (коллекций – АТСС, IFO, NRRL, BKM и др.) из 35 известных видов широко распространенного в природе плесневого гриба рода Curvularia проводят гидроксилирование ⁴-3-кетостероидов преимущественно в 11-положение и служат биокатализатором для получения гидрокортизона [2-27]. Достоинством вида С.lunata является также способность к 11-гидроксилированию как 21-гидроксистероидов, так и 21-метилсодержащих стероидов [2, 3, 27].

Несмотря на очень большое количество исследований, выполненных с различными штаммами грибов и, главным образом с С.lunata, процесс 11-гидроксилирования по-прежнему остается наименее управляемым.

Установлено, что 11-гидроксилирование с помощью С.lunata протекает только в аэрируемых условиях, как в процессе роста мицелия на питательной среде, так и в ее отсутствие, т.е. с помощью отмытой от среды и суспендированной в водном солевом растворе биомассы. Трансформацию в отсутствие питательной среды осуществляли с помощью свободного или иммобилизованного мицелия С.lunata [5-10,13]. Нерастворимые в воде стероидные субстраты вносили в реакционную среду в виде раствора в смешивающемся с водой органическом растворителе (этанол, метанол, диметилформамид и др.) или в виде мелкодисперсного порошка (МП) с размером частиц до 10-15 мкм [2]. Однако, в связи с токсичностью используемых растворителей для грибов-трансформаторов, нагрузка стероидов в реакционной среде не превышала 2 г/л.

Существуют способы использования стероидного субстрата – кортексолона и его ацетата с целью увеличения их растворимости в водной среде в виде комплекса с -циклодекстрином, однако растворимость в воде самого -циклодекстрина не позволяет поднять нагрузку стероида выше 4 г/л [10, 19, 20]. Проблема повышения растворимости и доступности стероидов для биокатализатора не решена как в работах с протопластами С.lunata, так и с иммобилизованным мицелием [5, 9, 13, 14].

Известно несколько способов введения 11-гидроксигруппы с помощью растущей культуры С.lunata. Например, различные 17-эфиры кортексолона и 17-ацетоксипрогестерон применяли в виде МП в количестве 0,25-2 г/л и трансформировали в течение 12-48 ч [22]. 21-Ацетат кортексолона трансформировали в гидрокортизон в течение 24 ч растущими культурами С.lunata KА-91 и С.lunata CL-114 при нагрузке субстрата 1 г/л [19,20]. Известен пример 11-гидроксилирования 21-ацетата кортексолона культурами Cunninghamella blakesleeana АТСС 8688а и Cunninghamella echinulata F-1307943, которые образовывали ацетат гидрокортизона в течение 24 ч при нагрузке ацетата кортексолона 0,15 г/л, растворенного в этаноле [21]. Предложен способ введения 11-гидроксигруппы в ацетат норэтистерона при нагрузке 1,25 г/л, растворенного в диметилформамиде. Трансформация с помощью С.lunata АТСС 12017 протекала 24 ч [23].

В отличие от вышеприведенных способов трансформации стероидных субстратов при нагрузках не выше 2 г/л, процесс введения 11-гидроксигруппы культурой С.lunata NRRL 2380 в 17-ацетат 6-метилпрегнадиендиона осуществляли при нагрузке субстрата 10 г/л, который вносили в питательную среду в виде МП и трансформировали 8-11 дней [24].

Однако для промышленного применения более предпочтительны способы 11-гидроксилирования, основанные на использовании биомассы С.lunata, суспендированной в буферном или физиологическом растворе. Таким способом получали 16,17-ацетонид гидрокортизона в ферментере с рабочим объемом 500 л. Субстрат – 16,17-ацетонид кортексолона в виде раствора в диметилформамиде вносили в суспензию мицелия, приготовленную на дистилированной воде. При нагрузке стероида 1 г/л трансформация заканчивалась за 6-10 ч [25]. С помощью мицелия С.lunata F/70, суспендированного в фосфатном буфере, получали 11-гидрокси-производное 16-метил-17,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3-она (ключевое соединение в синтезе дексаметазона) при нагрузке субстрата 0,2 г/л [26].

Недостатками описываемых способов 11-гидроксилирования являются либо низкое содержание трансформируемых субстратов, либо длительный период полной биоконверсии. К числу недостатков следует также отнести образование побочных гидроксистероидов, число которых может доходить до пяти и наличие которых усложняет выделение целевого продукта [2].

Известен способ, согласно которому трансформируемый субстрат использовали в виде МП, что позволило увеличить содержание кортексолона в среде до 10 г/л [7, 8]. Однако период трансформации при такой нагрузке субстрата, проводимой в фосфатном буфере с помощью свободного, а также иммобилизованного мицелия С.lunata ВКМ F-644, составил 168 ч. Конверсию кортексолона в гидрокортизон осуществляли с помощью мицелия в возрасте 48-60 ч, т.е. отмытым от питательной среды в стационарной фазе роста. Гидроксилирование проводили с таким количеством мицелия, чтобы отношение биомассы к стероиду составляло 1:1 (в расчете на сухую биомассу), при этом процесс заканчивался с образованием гидрокортизона и двух побочных гидроксистероидов.

Можно предположить, что количество используемого мицелия было недостаточным для быстрой конверсии 10 г/л кортексолона. В таком длительном процессе, проводимом культурой в условиях голода, неизбежно происходила ее возрастная деградация, следствием чего могли быть снижение селективности и стероидгидроксилирующей активности биокатализатора и деструкция продуктов трансформации. Имел значение также возраст мицелия, служившего биокатализатором. Из литературы известно, что наиболее высокая гидроксилазная активность наблюдается у мицелия в логарифмической фазе роста [2, 8, 12]. При старении культуры в реакционной среде могут появляться побочные продукты трансформации стероидной молекулы и продукты лизиса мицелия, которые отрицательно влияют на выход целевого продукта и усложняют его выделение. Кроме того, поскольку не растворимые в воде стероиды адсорбируются на мицелии, при высоком содержании в среде кристаллы кортексолона могут служить препятствием для достаточного доступа кислорода к биокатализатору. Эту гипотезу подтверждают данные работы с С.lunata CL-114, согласно которым выход гидрокортизона возрастал при дробной подаче субстрата [20], а также результаты 11-гидроксилирования кортексолона в виде водорастворимого комплекса с -циклодекстрином, выход гидрокортизона из которого был выше, чем из кортексолона в виде МП [10, 20].

Целью заявляемого изобретения является разработка эффективного способа 11-гидроксилирования ⁴-3-кетостероидов с помощью нового штамма Curvularia lunata ВКПМ F-988 с маркером резистентности к антибиотику генецитину “G-418”.

Для способа характерны высокая скорость и селективность процесса гидроксилирования в сочетании с полной конверсией стероидного субстрата при его высокой нагрузке. При нагрузке трансформируемого субстрата до 20 г/л трансформация протекает без деструкции стероидов за период не более 50 ч.

Сущность способа заключается в том, что для 11-гидроксилирования используют мицелий С.lunata ВКПМ F-988, отмытый от питательной среды в возрасте не более 30 ч, причем мицелий для реакции берут в таком количестве, чтобы отношение плотности биомассы гриба (по сухому весу) к весу трансформируемого стероида составляло 1,5-2,5:1.

Трансформируемые стероиды вносят в реакционную среду или в виде микрокристаллов – МП, либо в виде растворимого в водной среде комплекса с химически модифицированным -циклодекстрином, например с метил--циклодекстрином (МЦД). Известно, что химически модифицированные циклодекстрины повышают эффективность бактериальных процессов 1,2-дегидрирования стероидов и отщепления боковой цепи стеринов [29]. Однако для трансформаций, катализируемых грибами, механизм которых отличается от бактериального, химически модифицированные циклодекстрины не применялись.

Трансформация стероидов в виде комплекса с МЦД с помощью С.lunata ВКПМ F-988 протекала в 2 раза быстрее по сравнению с микрокристаллическим субстратом. Кроме того, в этом случае облегчалось выделение чистого гидроксипроизводного, так как субстрат и продукты реакции не накапливались на мицелии (таблица), тогда как при трансформации субстрата в виде МП на мицелии содержалась почти половина общего количества стероидов, которые экстрагировались вместе с внутриклеточной субстанцией.

Данное изобретение иллюстрируют следующие примеры, выход 11-гидроксисоединений (Y) в которых рассчитан по формуле: Y=100×P/(S×(Q_p/Q_s), где P – вес выделенного кристаллического продукта, S – количество взятого в реакцию субстрата, Q_p – молекулярный вес продукта, Q_s – молекулярный вес субстрата.

Пример 1. Трансформация кортексолона при нагрузке 10 г/л.

Суспензию спор штамм Curvularia lunata ВКПМ F-988, выращенного при 28°С в течение 120-140 ч на скошенном агаре следующего состава (г/л): глюкоза – 4,0, дрожжевой экстракт – 4,0, солодовый экстракт – 10, агар-агар – 25,0, вода дистиллированная, рН-6,8, переносят в жидкую среду в конические колбы объемом 750 мл со средой следующего состава (г/л): сахароза – 60,0, дрожжевой автолизат – 5,5, NaNO₃ – 3,5, NH₄H₂PO₄ – 6,5, K₂HPO₄ – 2,0, KCl – 0,5, MgSO₄ – 1,0, рН 6.0-6.1, и выращивают мицелий в аэробных условиях при скорости перемешивания 220-250 об/мин и температуре 28°С до конца стадии логарифмического роста. Полученный посевной материал переносят в свежую среду того же состава и проводят выращивание в аналогичных условиях. Через 24 часа роста полученный мицелий отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, отделяют от воды, взвешивают и переносят в количестве, соответствующем по весу 10-11 г сухой биомассы, в 0,75 л 0,07 М фосфатного буфера, рН – 6.0-6.1, содержащего 7,5 г микронизированного стероидного субстрата с содержанием 95% основного вещества – кортексолона (7,12 г в 100%-ном исчислении). Полученную суспензию распределяют в 12 качалочных колб и проводят трансформацию в течение 46 ч (до исчезновения исходного субстрата) в аэробных условиях, при скорости перемешивания 220-250 об/мин и температуре 28°С.

Мицелий отделяют от водной фазы и дважды экстрагируют этилацетатом. Водную фазу трижды экстрагируют этилацетатом, полученные экстракты упаривают, сухие остатки взвешивают и определяют в них содержание стероидных продуктов с помощью ВЭЖХ, после чего взвешенные остатки объединяют. Получают 6,75 г технического продукта, который обрабатывают при перемешивании 30 мл гексана. Гексан отделяют и остаток растворяют в 60 мл смеси CHCl₃:МеОН (7,5:1). К этому раствору по каплям при перемешивании прибавляют 400 мл воды. Полученный осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством СНСl₃, сушат при 60°С. Получают 3,2 г кристаллического гидрокортизона с т.пл. 211-214°С, идентичного стандартному образцу (ИК, ПМР-спектры). Выход 43,2%. Из хлороформного маточника выделяют 2,2 г (31%) смеси 14-гидрокси- и 11, 14-дигидроксикортексолона (ТСХ и ВЭЖХ-анализ).

Пример 2. Трансформация кортексолона при нагрузке 10 г/л в виде комплекса с МЦД.

Влажный мицелий в количестве, соответствующем по весу 12-13 г сухой биомассы, полученный по примеру 1, вносят в 1,0 л фосфатного буфера, содержащего 10 г кортексолона (9,5 г в 100%-ном исчислении) и метил--циклодекстрин (МЦД) в отношении стероид/МЦД 1:1 (моль/моль). Инкубируют на качалке 22 ч в условиях примера 1 ч. Мицелий отделяют от водной фазы, экстрагируют этилацетатом и определяют с помощью ТСХ отсутствие стероидных продуктов в полученном экстракте. Водную фазу трижды экстрагируют этилацетатом. После упаривания экстракта получают 8,93 г технического продукта, который обрабатывают аналогично примеру 1 и получают 5,76 г (58%) кристаллического гидрокортизона с т.пл. 210-214°С. Из хлороформной фракции получают 2,1 г (21%) 14-гидрокси-кортексолона, идентичного по ТСХ и ВЭЖХ стандартному образцу.

Пример 3.

Аналогично примеру 2 проводили трансформацию 3,75 г кортексолона (3,56 г в 100%-ном исчислении) при нагрузке 15 г/л, а также выделяли и очищали продукт трансформации. Отношение биомассы (в пересчете на вес сухого мицелия)/стероид составляло 2:1, отношение стероид/МЦД – 1/1 (моль/моль). Продолжительность трансформации 24 ч. Получено 3,72 г технического продукта. Выделено 2,01 г (56,4% теор.) кристаллич. гидрокортизона и 0,85 г (23% теор.) кристаллич. 14-гидрокси-кортексолона.

Пример 4.

Проводили трансформацию кортексолона с МЦД при нагрузке 20 г/л.

а) Аналогично примеру 2 проводили трансформацию, выделяли и очищали продукт трансформации. Количество загруженного на трансформацию субстрата составляло 7 г (6,65 в 100%-ном исчислении). Отношение биомасса/стероид составляло 2,5:1. Продолжительность полной конверсии кортексолона – 48 ч. Получено 6,0 г технического продукта. Выделено 3,82 г (55% теор.) кристаллич. гидрокортизона и 1,5 г (21,5% теор.) кристаллич. 14-гидроксикортексолона.

б) Аналогично пункту (а) проводили трансформацию 5 г кортексолона (4,75 г в 100%-ном исчислении), выделение и очистку продукта реакции. Использовали соотношение МЦД/стероид 0,6/1 (моль/моль). Продолжительность трансформации 50 ч. Получено 4.0 г технического продукта. Выделено 2,6 г (52% теор.) кристаллич. гидрокортизона и 0,95 г (19% теор.) 14-гидроксикортексолона.

Пример 5. Трансформация 21-ацетата кортексолона при нагрузке 10 г/л.

Аналогично примеру 2 трансформировали 5 г 21-ацетата кортексолона (4,5 г в 100%-ном исчислении) в течение 48 ч. Выделение проводили согласно примеру 2. Получено 3,36 г технического продукта. Выделено 2,15 г (51%) теор.) кристаллич. гидрокортизона и 0,84 г 14-гидрокси-кортексолона (21% теор.).

Пример 6. Получение 16-метилгидрокортизона из 21-ацетата 16-метил кортексолона.

Трансформацию 3 г 21-ацетата 16-метил-прегн-4-ен-17,21-диол-3,20-диона в виде комплекса с МЦД (при соотношении стероид/МЦД 1/4) проводили при нагрузке стероида 10 г/л в течение 40 ч, используя отношение биомассы к стероиду 2,5:1. Мицелий, не содержащий продукта трансформации, отделяли от водной фазы. Водную фазу экстрагировали этилацетатом. Экстракт упаривали. К остатку добавляли равное по объему количество хлороформа, выпавший осадок отфильтровывали и сушили при 65°С. Получено 1,32 г технического 11-гидроксипродукта (выход 50%). После кристаллизации продукт был идентичен образцу 16-метил-гидрокортизона [26].

Пример 7. Получение 11-гидрокситестостерона из тестостерона.

Трансформацию 4 г химически чистого тестостерона проводили в условиях примера 2 в течение 24 ч при нагрузке 5 г/л. Мицелий и водную фазу экстрагировали отдельно. Экстракты, содержащие по данным ТСХ примерно одинаковое количество продуктов реакции, объединяли, упаривали и получали 3,8 г технического продукта, который растворяли в 30 мл метанола. К метанольному раствору прибавляли 5 мл воды. Полученную смесь охлаждали до 5-7°С в течение 3 ч. Отделяли кристаллический осадок. Промывали его охлажденным метанолом, сушили и получали 2,53 г (выход 60%) 11-гидрокситестостерона с т.пл. 232-235°С. Лит.235-236.5°С [30].¹Н ПМР (CDCl₃, ) 1,01 (3Н, с, Н-18), 1,42 (3Н, с, Н-19), 3,58 (1H, кв, ³J=8,8 Гц, Н-17), 4,36 (1Н, м, J=9,4 Гц Н-11), 5,65 (1Н, с, Н-4).

Пример 8. Получение 11,17-дигидроксипрогестерона.

Трансформацию 2,4 г химически чистого 17-гидроксипрогестерона проводили в условиях примера 2 в течение 24 ч при нагрузке 5 г/л. Мицелий и водную фазу экстрагировали отдельно. После упаривания экстракта водной фазы (ТСХ показала отсутствие стероидов на мицелии) получили 2,2 г технического продукта, который промыли 1-1,2 мл ацетона. Получено 2,0 г (80%) кристаллического 11,17,-дигидроксипрогестерона, т.пл. 223-225°С. Лит.226-228°С. [31]. ¹Н ПМР (CDC1₃, ): 1,0 (3Н, с, Н-18), 1,4 (3Н, с, Н-19), 2,27 (3Н, с, Н-21), 2,72 (1H уш.с, 17-ОН), 4,45(1Н, м, Н-11), 5,66 (1H, с, Н-4).

Пример 9. Получение 11-гидроксипроизводного 20-гидрокси-метилпрегна-1,4-диен-3-она (ГМПД).

Аналогично примеру 2 трансформировали 1,0 г ГМПД в течение 24 ч при нагрузке 4 г/л. Водную фазу экстрагировали этилацетатом (на мицелии стероиды отсутствовали). После упаривания экстракта получено 0,95 г смеси гидроксипроизводных ГМПД, которую делили препаративно на SiO₂. Стероиды элюировали смесью CHCl₃/ацетон 7:2. Выделено 0,45 г (43%) 11,20-дигидроксиметилпрегна-1,4-диен-3-она (¹Н ПМР (CDCl₃, ): 0,86 (3Н, с, Н-18), 1,35 (3Н, с, Н-19), 4,15 (1Н, кв, Н-11), 5.8 (1H, с, Н-4), 6,03 (1H, д, Н-2), 7,24 (1H, д, Н-1) и 0,26 г (25%) 7,20-дигидроксиметилпрегна-1,2-диен-3-она. ¹Н ПМР (CDCl₃, ): 1,02 (3Н с, Н-18), 1,24 (3Н, с, Н-19), 4,2 (1H, т, J=15,5 гц, Н-7), 6.1 (1H, д, Н-4), 6.2 (1Н, д, Н-2), 7.05 (1H, м, Н-1).

Пример 10. Получение 11-гидроксипроизводного прогестерона.

Аналогично примеру 2 трансформировали 1,0 г прогестерона в течение 25 ч при нагрузке 2 г/л. Водную фазу экстрагировали этилацетатом (на мицелии стероиды отсутствовали). После упаривания экстракта получено 0,8 г кристаллического осадка, состоящего из смеси 2 гидроксипроизводных прогестерона в отношении 1:1, идентифицированных как 11-гидроксипрогестерон (¹Н ПМР (CDCl₃, ): 0,99 (3Н, с, Н-18), 1,43 (3Н, с, Н-19), 2,1 (3Н, с, Н-21), 3.16 (1Н, м, Н-17), 4,29 (1Н, м, Н-11), 5.66 (1Н, с, Н-4) и 6-гидроксипрогестерон (¹Н ПМР (CDCl₃, ): 0,73 (3Н, с, Н-18), 1,19 (3Н, с, Н-19), 2,1 (3Н, с, Н-21), 3,16 (1Н, м, Н-17), 4.39 (1Н, м, Н-6), 5,79 (1H, с, Н-4).

Источники информации

1. Машковский М.Д. / Лекарственные средства. М.: ООО «Новая Волна». 2002.

2. Sedlaczek L. / Crit. Rev. Biotechnol. V.7. N.3. P.187-236. 1988.

3. Mahato S.B., Garai S. / Steroids. V.62. P.332-345. 1997.

4. Dulaney E.L., Stapley E.O. / Appl. Microbiol. V.7. P.276-284. 1959.

5. Sonomoto K., Hog M.M., Tanaka A., Fukui S. / Appl. Environ. Microbiol. V.45. P.436-443. 1983.

6. Ангелова Б.А., Суходольская Г.В., Кощеенко К.A. / Микробиология. T.54. C.704-709. 1985.

7. Суходольская Г.В., Ангелова Б.А., Кощеенко К.A. и др. / Патент РФ 1411336 А1. Бюл. 27. 23.07.88.

8. Суходольская Г.В., Ангелова Б.А., Кощеенко К.Д., Скрябин Г.К. / Прикладная биохим. микробиол. Т.27. С.436-443. 1991.

9. Chen K.С., Wey Н.С. / Enzyme Microbiol. Technol. V.12. P.616-621. 1990.

10. Чинчолкар С.Б., Суходольская Г.В., Баклашова Т.Г., Кощеенко К.А. / Прикл. Биохим. Микробиол. Т.62. С.685-693. 1992.

11. Sedlaczek L., Milczarek K., Wilmanska D. et al. / Poland Patent 161090. 1993.

12. Santhanam H.K., Shreve G.S. / Biotechnol. Prog. V.10. P.187-192. 1994.

13. Wang J., Chen С., Li В., Zhang J., Yu Y. / Enz. Microbiol. Technol. V.22. P.368-373. 1998.

14. Paraszkiewicz K., Dlugonski J. / J.Biotechnol. V.65. P.217-224. 1998.

15. LuW.Y., Du L.X., WangM., Wen j.P., Sun В., Guo Y.W. Biochem. Eng. J. V.32. P.233-238. 2006.

16. Ohlson S., Flygare S., Larsson P.O., Mosbach K. / Eur. J.Microbiol. Biotechnol. 1980. V.10. P.1-9.

17. Manosroi J., Christi Y., Manosroi A. / Appl. Biochem. Microbiol. V.42. P.547-551. 2006.

18. Manosroi J., Saowakhon S., Manosroi A. / Enzyme Microbiol. Tecnol. V.41. P.322-325. 2007.

19. Lu W., Du L, Wang M, Jia X., Wen Y., Huong y., Guo Y., Cong W.,. Bao H., Yang J., Sun B. / Appl. Biochem. Biotecnol. V.142. N.1. 2007.

20. Lu W., Du L., Wang M., Guo Y., Sun В., Wen J., Jia X. / Food and Bioprod. Proc. V.85. P.63-72. 2007.

22. Голланд. патент 6605514 / Chem.Abstr. V.69. P.77624P. 1968. 6. C.56-58. 1990.

23. Chosson P., Vidal H., Aumelas A., Couderc F. / Microbiol. Lett. V.83. P.17-22. 1991.

24. Perlman B.A., White M.Y., Gilbert G. / US Pat 6828120. 2004.

25. Rolland G.J., Mantica L., Ciceri R. / Italian Pat. 513843. 1971.

26. Умнова Э.Ф., Рыжкова B.M., Воробьева Л.И. / Хим.-Фарм. Журн. Т.24. С.56-57. 1990.

27. Турута A.M., Камерницкий А.В., Коробов А.А и др. / Хим.-Фарм. Журн. Т.24. С.52-55. 1990.

Формула изобретения

1. Способ 11-гидроксилирования ⁴-3-кетостероидов с помощью гриба Curvularia lunata, отличающийся тем, что для проведения процесса используют биомассу мицелия штамма Curvularia lunata ВКПМ F-988, а трансформируемый стероид вносят в виде суспензии микрокристаллов либо предпочтительно в виде комплекса с метил--циклодекстрином при соотношении метилциклодекстрин-стероид 1:1-0,6:1 (моль/моль).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что возраст мицелия Curvularia lunata не превышает 30 ч, а отношение биомассы мицелия к трансформированному стероиду составляет 1,5-2,5:1.