Патент на изобретение №2399383

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНТРОЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АНТИКАРДИОЛИПИНОВЫХ АНТИТЕЛ В КОЛИЧЕСТВЕННОЙ РЕАКЦИИ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА СИФИЛИС

(57) Реферат:

Изобретение относится к получению диагностических препаратов. Способ осуществляется путем интратестикулярного заражения кроликов-продуцентов весом 3,0-3,5 кг патогенным штаммом Никольса Т. Pallidum pallidum. Через 7-8 суток после заражения животных дополнительно дважды внутривенно иммунизируют очищенными протеинами трепонем (ОПТ-антигеном), выделенными из КСТ-антигена культуральных бледных трепонем, в дозе 0,023 г с интервалом 7-8 суток. Обескровливание животных проводят через 30 суток после заражения. В полученных сыворотках определяют титр антикардиолипиновых антител в количественной реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном. Способ позволяет повысить титр антикардиолипиновых антител, стандартизировать постановку количественной реакции микропреципитации с кардиолипином на сифилис, сократить вдвое время учета полученных результатов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению диагностических препаратов, и может быть использовано в производстве диагностических сывороток для контроля количественной реакции микропреципитации с кардиолипином (КРМП-К) на сифилис.

Изобретение решает задачи организации производства недорогой диагностической сыворотки для контроля результатов КРМП-К на сифилис.

При сифилисе иммунитет существенно отличается по своему характеру от иммунитета при других инфекционных заболеваниях людей и животных. Течение болезни сопровождается выработкой двух видов антител: неспецифических – антикардиолипиновых (реагинов) и специфических – противотрепонемных. Реагины вступают в реакцию in vitro с кардиолипиновым антигеном (дифосфатидиглицерин), экстрагированным из мышц бычьих сердец, и выявляются в реакции связывания комплемента (РСК – реакция Вассермана), количественной реакции микропреципитации с кардиолипином (КРМП-К), реакции флокуляции для экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС). Реагины продуцируются и определяются в сыворотке у всех больных сифилисом, но не обладают защитным действием от инфекции, однако их наличие вместе с антитрепонемными антителами говорит о заболевании сифилисом и наличии в организме вегетативных форм патогенной Т. Pallidum pallidum (возбудителя сифилиса). Специфические противотрепонемные антитела (IgY и IgM) вырабатываются под влиянием протеиновых антигенов возбудителя сифилиса. Выздоровевшие от инфекции на фоне лечения могут вторично заразиться и заболеть. Иммунитет при сифилисе является «нестерильным» – «инфекционным» и характеризуется клеточными и гуморальными защитными реакциями, обуславливающими образование первичного шанкра, генерализацию инфекции на фоне выработки в крови больного обеих видов антител (О.К.Поздеев под ред. В.Н. Покровского. Медицинская микробиология. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001, с.433-434, А.И.Коротяев, С.А.Бабичев. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – СПб.: Спец. Лит., 2002, с.486-478).

В настоящее время сифилис приобрел эпидемическое распространение как в развитых, так и в развивающихся странах. Ведущее значение в борьбе с распространением инфекции занимает своевременная ее диагностика, однако промышленный выпуск отечественных недорогих контрольных стандартизированных диагностических препаратов на сифилис для использования в серологических лабораториях различных уровней налажен недостаточно.

Известен способ получения противосифилитической диагностической контрольной сыворотки для РСК (Фармакопейная статья «Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, положительная, сухая, для РСК» ФС 42-12 ВС-91, утвержденная Фармакопейным комитетом МЗ СССР 04.07.91 г.). Недостатком данного способа является высокая стоимость сыворотки, связанная с низкими титрами антикардиолипиновых антител (от 1:12 до 1:15 до сушки и 1:10 после сушки сывороток), и использование в этой связи в производстве цельных сывороток крови кроликов с экспериментальным сифилисом большого количества кроликов-продуцентов для получения требуемых объемов выпуска препарата.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса в РСК (Патент РФ 2185856 «Способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса». Пожарская В.О., Гуртовой Е.А., Ермолов А.В. Опубл. 27.07.2002 Бюл. 21). Способ осуществляется путем интратестикулярного заражения кроликов весом 3,0-3,5 кг патогенным штаммом Никольса Т. Pallidum pallidum, через 7-8 суток после заражения животных дважды с интервалом 7-8 суток иммунизируют внутривенно клеточными структурами трепонем (КСТ-антигеном) из культуральных бледных трепонем (КБТ) с последующим обескровливанием животных через 30 суток после заражения. Биомассу бледных трепонем выращивают на искусственной тиогликолевой среде из полного набора штаммов трех антигенных групп с последующей дезинтеграцией клеток ультразвуком, центрифугированием, отделением неразрушенных трепонем, центрифугированием надосадочной жидкости, выделением осадка стенок трепонем и супернатанта (Патент РФ 2141339 «Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем». Пожарская В.О. Опубл. 20.11.99 г. Бюл. 32). Способ позволяет повысить средние титры антикардиолипиновых антител в РСК с разведения 1:15 до 1:40 в крови обескровленных животных.

Согласно приказам МЗ РФ 87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (п.2.1. приложение 1) и 327 от 25.07.2003 г. «Об утверждении протокола ведения больных «Сифилис» (составленного на основе Методических указаний ЦНИКВИ «Лечение и профилактика сифилиса». М.: 1999) в комплекс серологических реакций (КСР) на сифилис введен тест КРМП-К с целью контроля за наличием и динамикой изменения титров антикардиолипиновых антител (реагинов) для диагностики заболевания сифилисом в серологических лабораториях всех уровней: региональных, краевых, районных, а также для контроля эффективности специфического лечения сифилитической инфекции совместно с тестом реакции гемагглютинации (РГА) – трепонемной на сифилис. Однако контрольная сыворотка для диагностики антикардиолипиновых антител в КРМП-К на сифилис не выпускается и требуется ежедневное их титрование перед постановкой КРМП-К согласно тому же приказу МЗ РФ 87 от 26.03.2001 г. (стр.4-6), что вдвое увеличивает время постановки и учета результатов исследуемых сывороток на сифилис в этой реакции.

Целью изобретения является возможность организации промышленного выпуска контрольной сыворотки для диагностики антикардиолипиновых антител в КРМП-К на сифилис и снижение временных затрат для постановки реакции в серологических лабораториях всех уровней вдвое, а также – снижение затрат на ее производство за счет увеличения титров антикардиолипиновых антител путем иммунизации кроликов с экспериментальным сифилисом очищенными протеинами трепонем (ОПТ), полученных из КСТ КБТ, и соответственным уменьшением количества используемых животных-продуцентов.

Поставленная цель достигается тем, что кроликов весом 3,0-3,5 кг интратестикулярно заражают патогенным штаммом Никольса Т. Pallidum pallidum. Через 7-8 суток после заражения животных дополнительно дважды с интервалом 7-8 суток иммунизируют внутривенно в дозе 0,023 г очищенными протеинами трепонем (ОПТ), полученных из КСТ КБТ, затем на 30-31 сутки после заражения животных обескровливают, получают сыворотку, определяют титры антикардиолипиновых антител в КРМП-К, стандартизируют, разливают и сушат готовый препарат.

ОПТ-антиген для иммунизации кроликов с экспериментальным сифилисом получают из КСТ-антигена путем освобождения его от общих групповых антигенов (Патент РФ 2156467 «Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса». Шавырина М.В., Ермолов В.В., Пожарская В.О., Тельбух В.П. Опубл. 20.09.2000 г. Бюл. 26).

По отношению к вышеописанным прототипам заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Дополнительная иммунизация после заражения кроликов патогенным штаммом Никольса Т. Pallidum pallidum проводится ОПТ-антигеном дважды в дозе 0,023 г, что приводит к более высокому уровню повышения титра антител к неспецифическому кардиолипиновому антигену как комплемент связывающих (в РСК), так и преципитинов (КРМП-К).

Если по прототипу иммунизация КСТ-антигеном положительные (4+) титры к антикардиолипиновому антигену в РСК выявляются в разведении 1:40, а в КРМП-К в разведении 1:8, то по предлагаемому способу (иммунизация ОПТ-антигеном) титры антикардиолипиновых антител в РСК выявляются в разведении 1:50-1:60, а в КРМП-К в разведении 1:32-1:40.

Полученные результаты говорят, что ОПТ-антиген значительно повышает титр не только комплементсвязывающих антител, но и преципитинов, что обосновывает его использование при получении контрольных положительных сывороток для постановки КРМП-К на сифилис.

По требованиям фармакопейной статьи выпускаемые сухие контрольные положительные сыворотки с кардиолипиновым антителом в РСК должны быть положительными не ниже, чем в разведении 1:10.

Согласно приказу МЗ РФ 87 от 26.03.01 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (п.2.1. приложение 1 стр.2 п.1, стр.4-6) при подготовке в лабораториях контрольных положительных сывороток ежедневным титрованием в качестве контроля используются положительные сыворотки в разведениях не ниже чем 1:8.

Возможность практического использования предлагаемого способа подтверждается примерами конкретного выполнения.

Базой для дальнейших исследований, отраженных выше, является стандартизация используемых антигенов КСТ и ОПТ по сухому весу (г) в 1 мл и вводимых кроликам-продуцентам с экспериментальным сифилисом, полученным по стандартной методике через 7 и 14 суток после заражения с обескровливанием их на 30 сутки (сроки максимальных титров антикардиолипиновых антител), готовили сыворотку крови по известной методике и определяли в ней титры антикардиолипиновых антител в РСК и в КРМП-К.

30 животным с экспериментальным сифилисом вводили внутривенно на 7 сутки после заражения 0,0115 г КСТ-антигена, на 14 сутки – 0,023 г КСТ-антигена. В сыворотках крови кроликов на 30 сутки средние титры антикардиолипиновых антител составили в РСК – 1:40, в КРМП-К – 1:8 (Патент РФ 2185856 «Способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса». Пожарская В.О., Гуртовой Е.А., Ермолов А.В., опубл. 27.07.2002 г. Бюл. 21).

Пример 1. Контрольная группа. 30 животным с экспериментальным сифилисом вводили внутривенно на 7 и 14 сутки после заражения по 0,023 г КСТ-антигена. В сыворотках крови кроликов на 30 сутки средние титры антикардиолипиновых антител составили в РСК – 1:43±2,1, в КРМП-К – 1:9±1,3. Смесь сывороток, полученных от 30 кроликов, составила титр антикардиолипиновых антител в РСК – 1:45, в КРМП-К 1:10. Таким образом, сравнительные титры полученных антикардиолипиновых антител в РСК и в КРМП-К оказались в 1,012 и 1,25 раза больше соответственно и являются стандартным фоном для сравнения введенного такого же количества ОПТ-антигена (0,023 г).

Пример 2. Предлагаемый способ. 30 животным с экспериментальным сифилисом на 7 и 14 сутки после заражения вводили внутривенно по 0,023 г ОПТ-антигена. В сыворотках крови кроликов на 30 сутки средние титры антикардиолипиновых антител составили в РСК – 1:57±2,8, в КРМП-К – 1:36±3,8. Смесь сывороток, полученных от 30 кроликов, при титровании показала титр антикардиолипиновых антител в РСК 1:55 в КРМП-К 1:34.

Полученные сравнительные результаты позволяют установить достоверное Р<0.01 увеличение титра преципитирующих антикардиолипиновых антител. При иммунизации кроликов ОПТ-антигеном в КРМП-К предложенным способом иммунизации, который превысил титр контроля в 3,4 раза, одновременно сравнительные титры антикардиолипиновых антител в РСК превысили контроль в 1,2 раза, что говорит о более высокой активации выработки антикардиолипиновых антител у кроликов с экспериментальным сифилисом при введении им ОПТ-антигена.

При производственном выпуске контрольных сывороток стандартизация (розлив, сушка), с учетом производственных потерь до 20%, требовала при выходе на розлив сыворотки иметь титры антикардиолипиновых антител в КРМП-К, доведенные до 1:10.

Полученные контрольные серии производственного выпуска сывороток показали титры антикардиолипиновых антител в КРМП-К в разведении 1:8. Учитывая титры преципитинов в сыворотках при постановке КРМП-К, можно определить степень разведения как 1:2 или 1:2,5, что значительно повышает количество объема выпускаемых сывороток, обеспечивая их более низкую стоимость (уменьшения числа продуцентов сывороток), а также вдвое сокращает время получения результатов исследования на сифилис в КРМП-К.

Контрольные производственные серии препарата прошли испытания на базах Филиала СГУП «НПО Микроген» МЗ РФ «Аллерген» в г.Ставрополе и Ставропольского краевого кожно-венерологического диспансера (серологическая лаборатория).

Готовятся к выпуску производственные серии контрольных положительных сывороток для диагностики антикардиолипиновых антител в КРМП-К на сифилис и документация к ним для утверждения выпуска препарата.

Таким образом, изобретение реально осуществимо, его использование в биотехнологии обеспечит впервые в РФ промышленное стандартное производство недорогих контрольных сывороток для КРМП-К на сифилис, что повысит эффективность контроля диагностики сифилиса, а сокращение времени получения результатов исследования снизит трудозатраты на постановку КРМП-К в среднем на 40-60%.

Формула изобретения

Способ получения контрольной сыворотки для диагностики антикардиолипиновых антител в количественной реакции микропреципитации на сифилис, включающий интратестикулярное заражение кроликов весом 3-3,5 кг патогенным штаммом Никольса Т. Pallidum pallidum, обескровливания животных, получение сыворотки, определение антикардиолипиновых антител в количественной реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном, отличающийся тем, что зараженных кроликов через 7-8 сут дополнительно внутривенно дважды иммунизируют очищенными протеинами трепонем, выделенными из КСТ-антигена культуральных бледных трепонем, в дозе 0,023 г с интервалом 7-8 сут, обескровливание животных осуществляют через 30 сут после заражения.