Патент на изобретение №2399377

(54) АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины. Антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, представляет собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, полученный экстракцией измельченной коры березы водой при кипячении, концентрированием водного экстракта и насыщением его хлоридом натрия, удалением образующегося осадка, экстракцией фильтрата этилацетатом, концентрированием фильтрата, разбавлением его хлороформом, отделением выпавшего осадка фильтрованием и его растворением с получением конечной концентрации 1,0-251,2 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности тромбина, и конечной концентрации 0,1-851,0 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства для профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).

Применяемый в нашей стране антикоагулянт прямого типа действия нефракционированный гепарин (НФГ) является полисахаридом с молекулярной массой 2-40 кД, в среднем 15 кД, и обладает рядом побочных нежелательных эффектов (остеопорозы, тромбоцитопении, повышение функциональной активности тромбоцитов, геморрагические осложнения). С целью разработки новых антикоагулянтных средств, лишенных побочных эффектов гепаринов, разрабатывают сульфатированные полисахариды (СП) растительного происхождения (выделенные из водорослей, лишайников, грибов, высших растений), а также выделенные из тканей морских беспозвоночных, членистоногих или млекопитающих [1-3]. Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [4], в них встраивают функциональные группы [5], объединяют [конъюгируют] с молекулами других полисахаридов [6]. Структура макромолекулы СП играет важную роль при проявлении антикоагулянтной активности (АА). Так, под действием модифицированного аргинином хитозана (конъюгат хитозан-аргинин) происходят конформационные изменения молекулы тромбина [7]. Введение функциональных групп для получения химически модифицированного N-propanoyl-, N-hexanoyl- и N,O-quaternary substituted сульфата хитозана приводит к увеличению АА [8]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный, при добавлении SO₃^– групп, снижается адгезия тромбоцитов и возрастает биосовместимость с кровью, которая положительно коррелирует с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [9]. Известно использование коры кедра для получения биологически активного соединения резвератрола [10]. Известен способ получения препарата Pycnogenol из коры сосны приморской, который является эффективным антиоксидантом, антикоагулянтом, капилляропротектором, а также проявляет противовирусный эффект и противовоспалительную активность [11].

Наиболее близким к заявляемому антикоагулянтному средству, по сути, является нефракционированный гепарин. Так, композиция, содержащая гепарин со средней величиной молекулярной массы, представляющая собой смесь сульфированных олигосахаридов, имеющих молекулярные массы от ~ 6000 до ~ 12000 Да, ингибирует тромбин, связанный с фибрином, и тромбин, находящийся в жидкой фазе, катализируя антитромбин, и ингибирует образование тромбина, катализируя инактивацию фактора Ха антитромбином [12].

Недостатком гепарина является то, что он обладает рядом побочных эффектов и то, что его выделяют из тканей млекопитающих [13].

Задачи изобретения:

1. Расширение сырьевой базы для получения растительных антикоагулянтов, свободных от вирусов и прионов.

2. Частичная утилизации коры березы.

Технический результат изобретения достигается тем, что предлагаемое антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, согласно изобретению, представляет собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, полученный экстракцией измельченной коры березы водой при кипячении, концентрированием водного экстракта и насыщением его хлоридом натрия, удалением образующегося осадка, экстракцией фильтрата этилацетатом, концентрированием фильтрата, разбавлением его хлороформом, отделением выпавшего осадка фильтрованием и его растворением с получением конечной концентрации 1,0-251,2 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности тромбина, и конечной концентрации 0,1-851,0 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха.

Исследовали влияние биологически активного комплекса из коры березы на изменение времени свертывания плазмы крови человека в коагулологических тестах активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови), РеаКлот НПО “Ренам” (влияние на активность фактора Ха) [14]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Ингибирование амидолитической активности тромбина и фактора Ха исследуемыми образцами изучали по изменению скорости расщепления хромогенных субстратов S-2238 или S-2222 при =405 нм. Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочные кривые 5-го Международного стандарта нефракционированного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. В колбу объемом 2 л, снабженную мешалкой и обратным холодильником, загружают 100 г измельченной березовой коры, заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1,5 часов. Затем горячий водный раствор отделяют фильтрованием, концентрируют на роторном испарителе до объема 350 мл, насыщают хлоридом натрия и отделяют образующийся осадок. Выделенный фильтрат трижды экстрагируют, используя по 250 мл этилацетата, сушат над безводным сульфатом натрия, затем этилацетатный раствор концентрируют под вакуумом до объема 50 мл и разбавляют хлороформом, при этом в осадок выпадают светло-кремовые хлопья биологически активного комплекса, которые отделяют фильтрованием.

Пример 2. К смеси 0,06 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО “Ренам”) добавляли 0,02 мл раствора биологически активного комплекса из коры березы в конечных концентрациях 1,0-251,2 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации биологически активного комплекса из коры березы (табл.1). Концентрация, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2аЧТВ), в сравнении с контрольным (40,3±3,3) составила 507±113 мкг/мл (табл.2). Для нефракционированного гепарина, выбранного в качестве стандарта, подобная величина составила 0,51±0,12 мкг/мл. Антитромбиновая активность (aIIa), рассчитанная по 5-ому Международному стандарту нефракционированного гепарина, составила 0,22±0,09 ЕД/мг и коррелировала с величиной 2аЧТВ.

Пример 3. К смеси 0,069 мл плазмы и 0,035 мл раствора фактора Ха (РеаКлот, НПО “Ренам” – определение влияния исследуемых веществ на активность фактора Ха в коагулологическом тесте) добавляли 0,01 мл раствора биологически активного комплекса из коры березы в конечных концентрациях 0,1-851,0 мкг/мл. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации образца (табл.1). Концентрация, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2РеаКлот), в сравнении с контрольным (13,4±1,5 сек) составила 891±71 мкг/мл (табл.2). Активность против фактор Ха (аХа) для образца, рассчитанная по 5-ому Международному стандарту нефракционированного гепарина, составила 0,15±0,05 ЕД/мг и коррелировала с величиной 2РеаКлот.

Таким образом, исследованный биологически активный комплекс из коры березы обладает антикоагулянтной активностью in vitro. Двойные эффективные концентрации коррелируют с антитромбиновой и анти-факторХа активностями. В сравнении со стандартом нефракционированного гепарина антитромбиновая активность много меньше, но для биологически активного комплекса из коры березы, который предполагают использовать per os, такая величина оптимальна.

Формула изобретения

Антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, отличающееся тем, что представляет собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, полученный экстракцией измельченной коры березы водой при кипячении, концентрированием водного экстракта и насыщением его хлоридом натрия, удалением образующегося осадка, экстракцией фильтрата этилацетатом, концентрированием фильтрата, разбавлением его хлороформом, отделением выпавшего осадка фильтрованием и его растворением с получением конечной концентрации 1,0-251,2 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности тромбина, и конечной концентрации 0,1-851,0 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха.