Патент на изобретение №2399055
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и касается способа диагностики туберкулезной инфекции. Способ заключается в изучении показателей количества рецепторов к липополисахаридам на моноцитах (CD14+) в пробе крови с гепарином; уровня биоцидной активности нейтрофилов при восстановлении нитросинего тетразолия без добавления пирогенала (НСТ-слот), количества циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), содержания кортизола и иммуноглобулина класса Е (IgE) в пробе крови без гепатина. В случае превышения значения показателей НСТ-слот 19,3%, IgE 100 МЕ/мл и кортизола 544,9 нмоль/л диагностируют туберкулезную инфекцию. Использование способа позволяет повысить точность выявления туберкулезной инфекции. 1 табл., 1 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения стадии туберкулезной инфекции. Внутрикожную пробу Манту проводят строго в асептических условиях. Одноразовым туберкулиновым шприцом со стерильной иглой
Рентгенодиагностика позволяет выявлять только локальные формы туберкулеза и применение этого метода ограничено из-за облучения пациентов рентгеновскими лучами. Задачей настоящего изобретения является разработка способа донозологической диагностики туберкулеза на основании изменений иммунологических показателей. Технический результат предлагаемого способа основан на определении количества моноцитов с рецептором CD14+, обуславливающих взаимодействие с МБТ, уровня нейтрофилов, способных ограничивать очаг воспаления в результате реакции спонтанного восстановления нитросинего тетразолия, синтеза мелкомолекулярных иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), отражающих суммарную активность гуморального и фагоцитарного звеньев иммуногенеза, иммуноглобулинов класса Е (IgE), являющихся косвенным показателем активации неадекватного для туберкулезной инфекции Th2 пути иммунного ответа и кортизола, который является маркером нейроэндокринных дисфункций, влияющих на работу иммунной системы. Технический результат достигается тем, что способ диагностики туберкулезной инфекции основан на выявлении отклонения от нормы в пределах двух ошибок количества моноцитов с рецептором CD14+, мелкомолекулярных иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), IgE, кортизола и уровня биоцидной активности нейтрофилов в тесте спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-спонт). Сущность способа достигается тем, что в основе способа диагностики туберкулезной инфекции лежит не только аллергическая перестройка организма, но и выявление комплекса иммунологических показателей, имеющих корреляционные взаимоотношения со всеми иммунологическими параметрами при патологическом процессе, вызванным туберкулезной инфекцией. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У больного берут кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых (1) содержит 250 мкл гепарина [разводим 5000 ЕД гепарина (5 мл) в 62,5 мл физиологического раствора]. Обе пробирки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляют надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином (1) рецепторы к липополисахаридам (CD14+) на моноцитах (Мц) определяют методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы “Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй (2) пробирки делят на 2 части. В содержимом одной части определяют восстановление нитросинего тетразолия (НСТ) в спонтанном тесте без добавления пирогенала (3). Пробу инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 мин, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин, прореагировавшие клетки наносят на предметное стекло и подсчитывают количество клеток, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части (4) цельной крови получают сыворотку и определяют количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%) с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации (5) и учитывают результат с помощью спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносят в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE (6) и кортизола (7) в реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Планшеты инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывают результаты на спектрофотометре. Принципиальная схема проведения лабораторных исследований отражена на чертеже. Примеры конкретного использования способа Пример 1 Больной X., 1992 года рождения, обратился в ГЛПУ ТО «ОПТД» по направлению фельдшера из школы с жалобами на зуд в области постпрививочного знака БЦЖ, увеличение его в размере в течение последнего года. БЦЖ поставлена в роддоме – рубец 12 мм. Проба Манту положительная во все годы наблюдения. 12.03.2007 г. поставлена проба Манту – размер папулы 15 мм. У больного взяли кровь в количестве по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала гепарин. Обе пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14+) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы “Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметные стекла и подсчитывали, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части цельной крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации, затем учитывали результат с помощью спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результаты на спектрофотометре. Результат иммунологического обследования: CD14+ – 88,2% (норма – от 72,4 до 98,4%) НСТ-спонт – 18% (норма – от 10,5 до 19,3%) ЦИК 7,5% – 43 усл. ед. опт. пл. (норма – от 27,3 до 186,5 усл. ед. опт. пл.) IgE – 24,1 МЕ/мл (норма – до 100 МЕ/мл) Кортизол – 237 нмоль/л (норма – от 200,0 до 544,9 нмоль/л). Показатели тестов CD14+ НСТ-спонт, ЦИК 7,5%, IgE, кортизола были в пределах физиологических норм здорового человека. Заключение. У больного туберкулезной инфекции нет. Клинический диагноз: Келлоидный рубец. Пример 2 Больная А., 1994 года рождения, поступила в стационар ГЛПУ ТО «ОПТД» 26.07.2007 г. с жалобами на субфебрилитет в течение 3 мес., сухой кашель в течение 2 мес. БЦЖ поставлена в роддоме – рубец 8 мм. Проба Манту положительная с рождения, в 2004 г. увеличение папулы на 6 мм. В ноябре 2006 г. поставлена проба Манту – размер папулы 11 мм. У больной взяли кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала 250 мкл гепарина. Пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14+) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы “Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметные стекла и изучали под микроскопом путем простого подсчета. Из другой части крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации. Учет результата проводили на спектрофотометре. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результат на спектрофотометре. Результат иммунологического обследования: CD14+ – 77,7% (норма – от 72,4 до 98,4%) НСТ-спонт – 49% (норма – от 10,5 до 19,3%) ЦИК 7,5% – 145 усл. ед. опт. пл. (норма – от 27,3 до 186,5 усл. ед. опт. пл.) IgE – 384 МЕ/мл (норма – до 100 МЕ/мл) Кортизол – 1133 мкм/л (норма – от 200,9 до 544,9 нмоль/л). Показатели тестов НСТ-спонт, IgE, кортизола были выше физиологических норм здорового человека. Заключение. У больной туберкулезная инфекция. Клинический диагноз: Инфильтративный туберкулез 6 сегмента правого легкого, фаза распада и обсеменения. МБТ(+) 1А группа. Заключение: учитывая положительную пробу Манту с рождения, можно предположить, что поствакцинальная аллергия сменилась развитием постинфекционной аллергии без документально подтвержденного угасания. Выявленные изменения по рентгенограмме свидетельствуют о давности специфического воспаления, приведшего к распаду легочной ткани и обсеменения окружающей ткани. Пример 3 Больная Б., 1990 года рождения, поступила в стационар ГЛПУ ТО «ОПТД» в 15.07.2007 г. Жалоб не предъявляет. БЦЖ в роддоме – рубец 4 мм. Проба Манту положительная монотонная с рождения. 15.07.2007 г поставлена проба Манту – папула 12 мм. У больной взяли кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала 250 мкл гепарина. Обе пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14+) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы “Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметное стекло и подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части цельной крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации. Учитывали результат с использованием спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результаты на спектрофотометре. Результат иммунологического обследования: CD14+ – 71,7% (норма – от 72,4 до 98,4%) НСТ-спонт – 49% (норма – от 10,5 до 19,3%) ЦИК 7,5% – 118 усл. ед. опт. пл. (норма – от 27,3 до 186,5 усл. ед. опт. пл.) IgE – 110 МЕ/мл (норма – 100 МЕ/мл) Кортизол – 769 нмоль/л (норма – от 200,0 до 544,9 нмоль/л) Показатели тестов НСТ-спонт, IgE, кортизола были выше физиологических норм здорового человека. Заключение. У больной активная форма туберкулеза. Клинический диагноз: Инфильтративный туберкулез 1-2 сегмента правого легкого, фаза распада. МБТ(-) 1А гр. Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для диагностики активных форм туберкулеза. Предложенный способ апробирован на базе ГЛПУ ТО «ОПТД» и ГЛПУ ТО «Противотуберкулезный санаторий Верхний Бор». Под наблюдением находилось 60 больных. В таблице представлены материальные затраты на проведение диагностики туберкулезной инфекции у одного больного при использовании пробы Манту и предлагаемого способа. Экономической эффект диагностики туберкулеза по сравнению с прототипом на 100 больных составляет 8056 руб. Предложен простой способ, не требующий больших материальных затрат, в 3 раза превышает эффективность лабораторной диагностики по сравнению с постановкой пробы Манту, в 75% обеспечивает совпадение диагностики туберкулеза с результатами клинического обследования больного и позволяет проводить донозологическую диагностику развития туберкулезной инфекции.
Формула изобретения
Способ диагностики туберкулезной инфекции включает забор крови у пациентов по 5 мл в две пробирки, одна из которых содержит 250 мкл гепарина, пробирки центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость; в пробе крови из пробирки с гепарином определяют содержание рецепторов к липополисахаридам на моноцитах (CD14+) методом проточной цитофлюориметрии с добавлением меченых моноклональных антител; в пробе второй пробирки определяют уровень биоцидной активности нейтрофилов при восстановлении нитросинего тетразолия без добавления пирогенала (НСТ-спонт), определяют количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%) с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) с помощью спектрофотометра, содержание кортизола и иммуноглобулина класса Е (IgE) определяют с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), а диагноз туберкулезной инфекции ставят на основании увеличения показателей НСТ-спонт выше 19,3%, IgE более 100 МЕ/мл и кортизола, превышающего 544,9 нмоль/л.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
6.
