Патент на изобретение №2398884

(54) РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА КОЛЬЦЕВОЙ ПЯТНИСТОСТИ РАСТЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение касается диагностического набора для определения наличия белка оболочки Prunus necrotic ringspot virus в растениях. Набор включает поликлональные антитела против белка оболочки этого вируса и пару праймеров: прямой 5′-праймер с последовательностью ID 1: CTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA и обратный 3′-праймер с последовательностью ID 2: GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC. Набор позволяет определить наличие вируса некротической кольцевой пятнистости Prunus в растениях. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается праймеров для определения вируса кольцевой пятнистости растений рода Prunus (PNRSV) в растительных тканях.

В частности, настоящее изобретение касается способа определения PNRSV в растениях с использованием праймеров для выявления PNRSV в растениях.

Настоящее изобретение также касается диагностического набора, применяемого для определения белка оболочки PNRSV в растениях.

Уровень техники

Вирус кольцевой пятнистости растений (PNRSV), относящийся к группе иларовирусов, поражает различные растения, включая хозяйственно важные культуры, в частности розы (разводимые для выращивания в садовых условиях, для срезки на продажу, а также для производства эфирного масла), яблони, хмель, персиковые, абрикосовые, сливовые и миндальные деревья. PNRSV был выявлен в розах и других хозяйственно важных растениях сотрудниками биотехнологической компании “Гималайские биоресурсы” (IHBT) в Палампуре (Индия) при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-PCR). Белок оболочки вируса кольцевой пятнистости и гены, обеспечивающие его транспорт, были клонированы и секвенированы в IHBT, Палампур. Были составлены прямой и обратный праймеры для амплификации полного белка оболочки данного вируса и генов его транспорта. Последовательности разработанных праймеров представлены в базу данных EMBL (PNRSVCP dn – AJ619983, PNRSVCP up – AJ619984, PNRSVMP up – AJ697738, PNRSVMP dn – AJ697739). С применением этих праймеров полный белок оболочки и гены транспорта PNRSV, выделенного из роз, были успешно клонированы, амплифицированы и секвенированы. Последовательности полного белка оболочки и генов его транспорта были представлены в базу данных EMBL (СР – AJ619958, МР – AJ697737). Сообщалось, что PNRSV по сравнению с другими вирусами преобладает в розах (Wong, S.M., Horst, R.K., Langhans, R.W. 1988, Symptomology and occurrence of Apple mosaic and Prunus necrotic ringspot viruses on rose in New York. Acta Horticulturae 234: 437-450) и растениях рода Prunus (Moury, В., Cardin, L., Onesto, J.P., Candresse, Т., Poupet, A. 2001, Survey of Prunus necrotic ringspot virus in rose and peach spp.Phytopathology 91: 84-91). Будучи широко распространен в розах, вирус кольцевой пятнистости существенно портит качество и количество цветков (количество цветков у зараженных растений на 25-30% меньше, чем у незараженных), а также влияет на длину стеблей и продолжительность жизни срезанных цветов (Moran, J.R., Faragher, J.D., Baker, D.M. 1988, The effect of Prunus necrotic ringspot virus on production and quality of rose flowers. Acta Horticulturae. 234:429-434; Thomas, B.J. 1981, The effects of Prunus necrotic ringspot virus on field grown roses. Annals of Applied Biology 100: 129-134). Обнаружено, что из числа привоев, несущих вирус, приживаются только 20%, тогда как прививки незараженных привоев успешны в 90% случаев (Stein, A., Levy, S., Loebenstein, G. 1988, Effects of Prunus necrotic ringspot virus on graft union and Flower quality of glasshouse grown roses in Israel. Acta Horticulturae 234:435). Изоляты вируса из персиков не оказывали заметного влияния на состояние листьев, но вызывали усыхание ветвей и побегов, а также гибель деревьев в целом. У зараженных деревьев количество листовых и цветочных почек, а также узлов уменьшалось на 66 – 96%, площадь листовых пластинок – на 14-80%; уменьшался также обхват ствола и ветвей на 42-71% (Topchiiska, M.L. 1983, Effects of Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus on some biological properties of peach. Acta Horticulturae 130:307-312). У вишни обыкновенной, зараженной PNRSV, сокращалась урожайность: 744,9 г плодов против 828,5 г с дерева. На рост вишневых деревьев вирус заметного влияния не оказывал (Ramsdell, D.C. Bird, G.W. Adler, V.A., Gillett, J.M. 1992, Effects of Tomato ringspot virus and Prunus necrotic ringspot virus alone and in combination on the growth and yield of Montmorency sour cherry. Acta Horticulturae 309:111-114). PNRSV также обнаружен у бегонии (Verma, N., Hallan, V., Ram, R., Zaidi, A. A., 2002, Detection of Prunus necrotic ringspot virus in begonia by RT-PCR. Plant Pathology, 51:800) и герани (неопубликованное сообщение).

Роза – одна из трех важнейших сельскохозяйственных растений, используемых в качестве срезанных цветов на продажу. Так как розы размножают черенкованием, вирусная инфекция передается из поколения в поколение через вегетативные органы растения. Для обеспечения чистоты генофонда (качества зародышевой плазмы) и минимизации вирусной зараженности различных культиваров, необходимо средство для надежной диагностики и контроля вирусных заболеваний; это критически важно для повышения урожайности.

По наблюдениям Томаса (Thomas, В.J. 1981, Studies on rose mosaic disease in field grown roses produced in the United Kingdom, Annals of Applied Biology 98:419-429) у роз кольцевая пятнистость (хлороз) вызывается преимущественно вишневым серотипом PNRSV, а яблоневый серотип (вирус мозаики яблонь, ApMV) поражает листья, которые становятся мелкими, морщинистыми, неправильной формы (Thomas, B.J. 1984, Rose mosaic disease: symptoms induced in roses by graft inoculation with both Peach necrotic ringspot and Apple mosaic viruses. Plant Pathology 33:155-160).

Традиционная диагностика вирусных заболеваний растений предполагает биологический анализ с использованием растений-индикаторов, включая распознавание симптомов, определение круга хозяев и морфологии вирусных частиц, выявление путей заражения. Но благодаря прогрессу в молекулярной биологии, биохимии и иммунологии разработаны новые, более точные и быстрые, менее трудоемкие способы определения вирусов. Вирусология располагает различными диагностическими методиками: преципитация, агглютинация, флуоресцентные антитела, твердофазный иммуноферментный анализ, электронная микроскопия (включая иммуноэлектронную), метод гибридизации макромолекул путем дот-блоттинга, тканевый блоттинг, вестерн-блоттинг, гибридизация нуклеиновых кислот с использованием радиоактивно- и нерадиоактивно меченных зондов и полимеразная цепная реакция.

Для определения PNRSV были использованы иммунодиффузия в геле и латексная агглютинация. Латексный тест был в 250 раз более чувствительным, чем иммунодиффузия в геле (Thomas, B.J. (1980), The detection by serological methods of viruses infecting the rose. Annals of Applied Biology 94: 91-101).

Для определения PNRSV у роз широко применялись твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и его модификации. Он позволяет выявить PNRSV и определить его серотип в различных растительных тканях в разные сроки вегетационного периода у целого ряда представителей семейства розоцветных. У всех изученных на этот предмет растений-хозяев (яблони, вишни, сливы и розы) цветки и окружающие их части растения, за исключением чашелистиков у роз, оказались хорошими источниками антигена. Штаммы серотипа “С” (у вишни) лучше определялись в листьях весной, чем в другое время года, а осенью лучше, чем в середине лета (хотя некоторые изоляты лучше определялись осенью). Штаммы серотипа А (яблоневая мозаика) лучше всего определялись весной, а в другое время года зачастую вообще не определялись (Barbara, D.J. (1981), Detecting Prunus necrotic ringspot virus in rosaceous hosts by enzyme-linked immunosorbent assay. Acta Horticulturae 94:329-332). Уонг и Хорст (Wong, S.M., Horst, R.K. (1988), Comparsion of antigen and antibody-coated enzyme-linked immunosorbent assay procedures for the detection of three isolates of purified Apple mosaic virus or Prunus necrotic ringspot virus. Acta Horticulturae 234:249-256) предложили систему иммуноферментного анализа для определения вируса кольцевой пятнистости у роз и сравнили чувствительность антигенной и антительной сорбции для определения этого вируса в неочищенных экстрактах. Антительная сорбция (DAS-ELISA) оказалась наиболее подходящей для определения PNRSV в неочищенных экстрактах, тогда как антигенная сорбция (Direct ELISA) не позволяла надежно определять PNRSV в неочищенных экстрактах растительных тканей. Для массового скрининга с целью выявления PNRSV у косточковых (миндаль, абрикос, вишня, нектарин, персик, слива и т.п.) предпочтителен метод ELISA (Salem, N., Mansour, A., Al-Musa, A., Al-Nsour, A. (2003), Incidence of Prunus necrotic ringspot virus in jordan. Phytopathologica Mediterranea 42:275-279; Scott, S.W., Barnett, O.W., Burrows, P.M. (1989), Distribution and prevalence of Prunus necrotic ringspot virus in peach orchards of South Carolina. Acta Horticulturae 235:137-142; Scott, S.W., Walker Miller, R., Bachman, E.J., (1992), Evidence for the spread of Prunus necrotic ringspot virus and the presence of Prune dwarf virus in selected peach orchards in South Carolina. Acta Horticulturae 309:73-78). Концентрация PNRSV различна в разные моменты вегетационного периода, в разных растениях и даже в разных органах одного и того же растения. Поэтому выбор образца и момента его сбора критически важны для надежности выявления вируса PNRSV в зараженных растениях, которые могут выглядеть здоровыми. (Dal Zotto, A., Nome, S.F., Di Rienzo, J.A., Docampo D.M., (1999), Fluctuations of Prunus necrotic ringspot virus at various stages of peach cultivars. Plant Disease 83:1055-1057). Наиболее надежные результаты получались для лепестков и листьев, собранных в начале вегетационного периода (Bertozzi, Т., Alberts E., Sedgley, M., (2002), Detection of Prunus necrotic ringspot virus in almond: effect of sampling time on the efficiency of serological and biological indexing methodologies. Australian Journal of Plant Pathology 42:207-210). PNRSV в листьях обычно лучше определялся весной, чем в другое время года, и осенью лучше, чем в середине зимы (Barbara, D.J. (1980), Detecting Prunus necrotic ringspot virus in rosaceous hosts by enzyme linked immunosorbent assay. Acta Phytopathologica-Academiae-Scientiarium-Hungaricae 15:329-332). Сезонные колебания концентрации вируса неодинаковы у различных культиваров, так что невозможно различать зараженные и незараженные деревья, если образцы брать в одно и то же время для всех культиваров (Salem, N., Mansour, A., Al-Musa, А., Al-Nsour, А. (2003), Seasonal variation of Prunus necrotic ringspot virus concentration in almond, peach, and plum cultivars. Phytopathologhica Mediterranea 42:155-160).

PNRSV имеет весьма широкий круг хозяев, и получено много разных изолятов, различающихся по биологическим, серологическим и молекулярным свойствам. При помощи поликлональных антител не удается идентифицировать различные изоляты вируса. Когда для этого применялись моноклональные антитела, вирус проявлял высокую серологическую вариабельность. При помощи моноклональных антител идентифицировано 34 серогруппы, из которых 64% специфичны к хозяину, 67%-регионоспецифичны (Mytra, A., Terlizzi, B.D., Boscia, D., Choueiri, E., Gatt, M., Gavriel, I., Caglayan, K.., Varveri, C., Zeramdini, H., Aparico, F., Pallas, V., Savino, V. (2001), Serological characterization of Mediterranean Prunus necrotic ringspot virus isolates. Journal of Plant Pathology 83(1):45-49). PNRSV весьма лабилен: его LIV (продолжительность жизни вирионов in vitro) составляет лишь 6-18 часов (Brunt, A.A, Crabtree K., Dallwitz, M.J., Gibbs A.J., Watson, L. (1966): Viruses of plants, CAB International, pp.1047-1049, University Press, Cambridge), так что его трудно получить в очищенном виде в количествах, достаточных для образования антител. Благодаря технологическому прогрессу в настоящее время созданы системы для экспрессии генов белков вирионной оболочки в Escherichia coli (E.coli). Петрицку с соавторами (Petrzik, K., Mraz, I., Kubelkova D. (2001), Preparation of recombinant coat protein of Prunus necrotic ringspot virus. Acta Virologica 45:61-63) удалось добиться экспрессии гена, кодирующего белок оболочки PNRSV, в клетках E.coli.

Помимо твердофазного иммуноферментного анализа для определения вирусов растений применяются различные методы электронной микроскопии (Corbett, М.K. (1974), Detection of viruses and diagnosis of plant viral diseases by electron microscopy. Acta Horticulturae 36:141-188). Для определения вируса кольцевой пятнистости применялась также серологически специфичная электронная микроскопия (SEEM) или иммуноэлектронная микроскопия (IEM). SEEM и ELISA оказались в 1000 и 200 раз, соответственно, чувствительнее латекс-иммобилизационного анализа. Последним методом и путем иммунодиффузии в геле не удается определить PNRSV в зараженных розах, тогда как определение при помощи ELISA дает вполне надежные результаты (Thomas, В.J. (1980), The detection by serological methods of viruses infecting in roses. Annals of Applied Biology 94:91-101). Электронная микроскопия (прокрашивание, сканирование, напыление) применялась для определения вируса кольцевой пятнистости в миндальных, сливовых и персиковых деревьях (Boullia, M., Marrakchi, M. (2001), Detection and characterization of stone fruit virus disease in tunisia. Phytopathologica Mediterranea 40:125-136).

Иммуномечение с использованием коллоидного золота и серебра применялось для выявления PNRSV в тканях персиковых деревьев. Метка сосредоточивалась в паренхиме коры. Иногда специфическое мечение наблюдалось также в некоторых клетках паренхимы ксилемы. Метка никогда не обнаруживалась в эпидермисе, сосудистой ткани, камбии или сердцевине. Почти все клетки паренхимы коры, черешков и стебля, но лишь немногие корневые клетки метились серебром. В паренхимных клетках метка распределялась в цитоплазме (Giunchedi, L., Poggi Pollini, С.(1989), Localization of Prunus necrotic ringspot virus antigen in peach tissue by immunogold-silver labelling. Acta Horticulturae 235:191-196).

В последние десять лет для определения вирусных геномов в зараженных растениях широко применяются различные модификации полимеразной цепной реакции (PCR). В отношении PNRSV полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией (RT-PCR), оказалась более чувствительным методом, чем ELISA. (Mekuria, G., Ramesh, S.A., Alberts, E., Bertozzi, Т., Wirthensohn, M., Collins, G., Sedgley, M. (2003), Comparison of ELISA and RT-PCR for detection of Prunus necritic ringspot virus and Prune dwarf virus in almond (Peach dulcis). Journal of Virological Methods 114:65-69). Применение RT-PCR для определения PNRSV включало амплификацию двух пар праймеров, дающих короткий и длинный продукты. Относительное количество короткого продукта было выше, чем длинного. В растительных тканях с низкой концентрацией вируса (латентная инфекция) вирус кольцевой пятнистости лучше определялся посредством амплификации короткого продукта PCR, а при высоком содержании вирусных частиц больше подходил длинный продукт (Rosner, A., Maslenin, L., Spiegel, S. (1997), The use of short and long PCR products for improved detection of Prunus necrotic ringspot virus in woody plants. Journal of Virological methods 67:135-141). Для определения различных вирусов одновременно применялась множественная PCR. Эта методика очень чувствительна для определения более чем одного вируса при смешанной инфекции растения (Mekuria, G., Ramesh, S.A., Alberts, E., Bertozzi, T., Wirthensohn, M., Collins, G., Sedgley, M. (2003), Comparison of ELISA and RT-PCR for the detection of Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in almond (Peach dulcis). Journal of Virological Methods 114:65-69). RT-PCR с иммунологической меткой как сама по себе, так и в комбинации с нестед-полимеразной цепной реакцией еще более чувствительна в отношении PNRSV. Последний метод позволяет преодолеть эффекты ингибирования и нестабильность результатов, получаемых при стандартной RT-PCR с иммуносвязыванием (IC-RT-PCR). Чувствительность нестед IC-RT-PCR на три порядка величины выше, чем DAS-ELISA при определении PNRSV в листьях (Helgurea, P.R., Toborda, R., Docampo, D.M., Ducasse, D.A. (2001), Immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction combined with nested PCR greatly increases the detection of Prunus necrotic ringspot virus in peach. Journal Virological Methods 95:93-100). PNRSV в природе представлен рядом биологически определенных вариантов, различающихся по специфичности к растениям-хозяевам, серологическим свойствам и вызываемым в растениях патологическим изменениям. Применение типоспецифических праймеров, позволяя амплифицировать долю гена, кодирующего белок оболочки, в ходе множественной PCR, обеспечивает быстрое выявление и идентификацию различных штаммов PNRSV (Hammond, R.W., Crossim, J.M., Pasini, R., Howell, W.E., Mink, G.I. (1999), Differentiation of closely related but biologically distinct cherry isolates of Prunus necrotic ringspot virus by polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 80:203-212).

Для определения PNRSV применялась также молекулярная гибридизация без радиоактивного мечения (Saade, M., Aparicio, F., Sanchez-Navarro, J.A., Herranz, M.C., Myrta, A., Di-Terlizzi, В., Pallas, V. (2000), Simultanious detection of the three ilarviruses affecting stone fruit trees by nonisotopic molecular hybridization and multiplex reverse-transcription polymerase chain reaction. Phytopathology 1330-1336). Другой подход включал клонирование частичной нуклеотидной последовательности вируса (включая PNRSV) наряду с синтезом уникального RNA-зонда (“Polyprobe”) для одновременного определения ряда вирусов (Herranz, M.C., Sanchez-Navarro, J.A., Aparicio, F., Pallas, V. (2004), Simultaneous detection of six stone fruit viruses by non-isotopic molecular hybridization using a unique riboprobe or “Polyprobe”. Journal of Virological Methods 124:49-55).

Таким образом, для определения PNRSV в розах и других растениях имеется ряд чувствительных методов: различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (DAS-ELISA), электронной микроскопии (включая иммуноэлектронную), полимеразной цепной реакции (RT-PCR, IC-RT-PCR) и молекулярной гибридизации. Однако для их практического применения требуется сложное дорогостоящее оборудование. Поэтому до сих пор для диагностики вирусных инфекций розы и других важных сельскохозяйственных культур, включая косточковые фруктовые деревья, герань, хмель и др., наиболее широко применялся ELISA, поскольку этот метод быстрый, относительно легкий в исполнении, может осуществляться в полевых условиях и не требует значительных денежных затрат. Для его практического применения удобны диагностические наборы.

Цели изобретения

– Главная цель настоящего изобретения – создание праймеров, применяемых для определения вируса кольцевой пятнистости (PNRSV) в растениях.

– Другая цель настоящего изобретения – создание способа определения PNRSV в растениях с использованием разработанных праймеров для определения данного вируса в растениях.

– Еще одна цель настоящего изобретения – создание диагностического набора для определения белка оболочки PNRSV в растениях.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение касается способа определения вируса кольцевой пятнистости (PNRSV) в растениях с применением разработанных праймеров:

Последовательность ID 1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA

Последовательность ID 2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC;

Настоящее изобретение касается также диагностического набора для определения белка оболочки PNRSV в растениях, включающего:

а) поликлональные антитела против белка оболочки PNRSV в растениях;

б) конъюгат, меченный щелочной фосфатазой;

в) буфер для сенсибилизации поверхности;

г) экстрагирующий буфер;

д) буфер ECI

е) буфер PNP.

Подробное описание изобретения

С целью разработки диагностического набора был амплифицирован полный белок оболочки PNRSV из роз с применением полученных праймеров, обеспечивающих амплификацию гена полного белка оболочки PNRSV. Чтобы подтвердить идентичность ампликонов, ген полного белка оболочки клонировали и установили его нуклеотидную последовательность. Затем он был клонирован в рамке считывания в векторе pGEX2TK, и была проведена трансформация штамма BL21 E.coli рекомбинантным вектором pGEX2TK, содержащим ген белка оболочки PNRSV. Условия экспрессии, в частности температуру индукции и концентрацию IPTG, стандартизовали для оптимальной экспрессии гена белка оболочки PNRSV. Оптимальная экспрессия имела место при 30°С и концентрации IPTG 1 мМ. Синтезированный белок выделяли из 250 мл культуры, затем двух кроликов иммунизировали 3 раза с недельными интервалами; каждый раз вводилось 100 мкг очищенного белка с полным адъювантом Фрейнда (Meenu Katoch, A.A., Zaidi and Raja Ram. (2002). Development of diagnostic kit for the detection of Bean yellow mosaic virus. Patent file no 76/NF/2002, Pending) внутримышечно и подкожно и один раз внутривенно таким же количеством белка в неполном адъюванте Фрейнда. Через 15 суток у кроликов брали кровь, из сыворотки выделяли антитела и хранили их при -20°С.

Соответственно настоящее изобретение предоставляет праймеры для определения PNRSV в растениях, включающие следующие последовательности:

Последовательность ID 1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA

Последовательность ID 2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC

Далее настоящее изобретение также предоставляет способ определения PNRSV в растениях, включающий:

а) получение очищенного белка оболочки PNRSV с применением разработанных праймеров;

последовательность ID 1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA

последовательность ID 2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC

б) получение поликлональных антител против белка оболочки PNRSV, полученного согласно п. а);

в) осуществление прямого твердофазного иммуноферментного анализа с использованием антител (DAS-ELISA) для определения PNRSV.

В воплощении настоящего изобретения полный белок оболочки PNRSV был амплифицирован с использованием разработанных праймеров, имеющих следующие последовательности:

последовательность ID 1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA

последовательность ID 2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC

В другом воплощении настоящего изобретения полный белок оболочки PNRSV с последовательностью ID 3:

клонируется в векторе pGEX2TK, и проводится трансформация штамма BL21 E.coli.

Далее в воплощении настоящего изобретения оптимальный синтез белка оболочки проверяется с IPTG в концентрации 0,5-0,9 мМ при температуре 30°С в течение 3-3,5 часов.

Далее в воплощении настоящего изобретения определяется аминокислотная последовательность полученного белка оболочки PNRSV при помощи стандартных методов секвенирования.

Далее в воплощении данного изобретения проводится очистка PNRSV стандартными методами.

Далее в воплощении настоящего изобретения проводится троекратная с недельными интервалами иммунизация кроликов очищенным белком оболочки, полученным на этапе 1(а), с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1.

В другом воплощении настоящего изобретения иммунизация осуществляется внутримышечно, подкожно или внутривенно.

Еще в одном воплощении данного изобретения у кроликов берут кровь через 14-15 суток для получения поликлональных антител против белка оболочки PNRSV.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения проводится очистка сывороточных поликлональных антител против белка оболочки PNRSV стандартными методами.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения титрационный микропланшет покрывают поликлональными антителами в буфере для сенсибилизации поверхности в разведении 1:500-1:1000, после чего 4-5 раз отмывают PBS-T.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения на титрационных микропланшетах готовились образцы из зараженной ткани листьев путем обработки экстракционным буферным раствором и разведения 1×-1/160× исходного антигена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения титрационные микропланшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, после чего промывали, чтобы произошло связывание антигена в лунках.

В еще одном воплощении настоящего изобретения добавляется конъюгат антител в буферном растворе ECI в соотношении 1:500-1:1000 примерно на 4 часа при примерно 37°С, после чего делается промывание PBS-T.

В еще одном воплощении настоящего изобретения в смесь добавляют около 100 мкл раствора пара-нитрофенилфосфата с концентрацией около 1 мг/мл в буфере PNP.

В еще одном воплощении настоящего изобретения реакция останавливается через 15-20 мин добавлением около 50 мл раствора NaOH с концентрацией около 3М, так что получается продукт желтого цвета.

В еще одном воплощении настоящего изобретения окрашенный продукт является конъюгатом антигена и антитела.

В еще одном воплощении настоящего изобретения измеряется поглощение света окрашенного продукта при длине волны 405 нм для определения PNRSV.

Далее, настоящее изобретение предоставляет диагностический набор для определения белка оболочки PNRSV, включающий:

а) поликлональные антитела против белка оболочки PNRSV в растениях;

б) конъюгат, меченный щелочной фосфатазой;

в) буфер для сенсибилизации поверхности;

г) экстракционный буфер;

д) буфер ECI;

е) буфер PNP.

Часть антител и конъюгат хранили в холодильнике (4-10°С), а другую часть – при комнатной температуре (20-35°С) для последующего использования в исследованиях. Результаты неизменно оказывались положительными для первой части, тогда как для другой части положительные результаты получались только в течение 2-3 месяцев при комнатной температуре и года при 4°С.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, и их не следует истолковывать как ограничивающие рамки настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Определение PNRSV из роз

Исследовались различные культивары розы с применением DAS-ELISA, как описано ниже. Параллельно они исследовались при помощи набора DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany), включаемого в настоящее изобретение в качестве отсылки.

Твердофазный иммуноферментный анализ с прямым иммуносэндвичем (DAS-ELISA)

1. На планшеты (Nunc Immuno TM Plant, Denmark) наносили 100 мкл поликлональных антител (в разведении 1:500-1:1000) в буфере для сенсибилизации поверхности, и планшеты инкубировали в течение 4 часов во влажной камере при 37°С.

2. Планшеты промывали фосфатным буфером с твином (PBS-T) по 2 минуты 5 раз.

3. Готовили образцы, обрабатывая зараженную ткань листьев буфером для экстракции (1 г/2 мл). Ряд разведении соответствовал разведению 1×-1/160× исходного антигена. Разведенный антиген (100 мкл) наносили пипеткой в лунки титрационного микропланшета согласно схеме нагрузки и инкубировали в течение ночи при 4°С во влажной камере, чтобы антиген покрыл лунки.

4. Планшет промывали PBS-T 5 раз по 2 минуты.

5. В лунки добавляли конъюгат антител (в разведении 1:500-1:1000) в буфере ECI (по 100 мкл в лунку). Планшеты инкубировали в течение 4 часов при 37°С во влажной камере.

6. Планшет еще раз промывали PBS-T в течение 2 минут 5 раз.

7. После промывания в лунки вносили по 100 мкл раствора пара-нитрофенилфосфата в буфере PNP (концентрация 1 мг/мл).

8. По достижении достаточного окрашивания (30 минут – 2 часа) реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл раствора NaOH (концентрация 3М).

9. На том же планшете ставились положительный и отрицательный контроль. Измерялось поглощение ELISA-планшета при 405 нм с помощью многоканального ридера для микропланшетов. Результат считался положительным, если наблюдаемое поглощение превышало 0,1, что, по меньшей мере, втрое больше базового уровня контроля (незараженная растительная ткань).

Результаты были положительными в положительном контрольном образце и отрицательными в отрицательном контрольном образце.

Буфер для сенсибилизации поверхности (0,05 М/л): 1,59 г карбоната натрия, 2,93 г бикарбоната натрия, рН 9,6.

Буфер PBS: 20 мМ фосфат натрия рН 7,4,150 мМ NaCl.

Буфер PBS-T: 20 мМ фосфат натрия рН 7,4; 150 мМ NaCl и 0,05% (по объему) Tween-20.

Экстракционный буфер: 1,3 г безводного фосфата натрия, 20 г поливинилпирролидона (PVP) с мол. массой 24-40 000; 0,2 г азида натрия; 2,0 г порошка яичного альбумина (степень чистоты II) и 20,0 г Tween-20 растворяют в 1000 мл 1×PBST и доводят рН до 7,4.

Буфер ECI: 2,0 г бычьего сывороточного альбумина, 20,0 г PVP 24-40000 и 0,2 г азида натрия растворяют в 1000 мл 1×PBST и доводят рН до 7,4.

Буфер PNP: 0,1 г хлорида магния, 0,2 г азида натрия и 97 мл диэтаноламина растворяют в 800 мл дистиллированной воды, доводят рН до 9,8, а объем до 1000 мл.

Таблица 1
Сравнение результатов ELISA для различных культиваров розы с применением предлагаемого в настоящем изобретении диагностического набора и стандартного набора
п/п	Культивар розы	ELISA с использованием стандартного набора	ELISA с использованием набора по изобретению
1.	Беззаботная любовь	+	+
2.	Голубая луна	+	+
3.	Девичья грусть	+	+
4.	Золотой гигант	+	+
5.	Оклахома	+	++
6.	Красный шедевр	+	+
7.	Поцелуй любви	+	+
8.	Счастье	+	+
9.	Сабей	+	+
10.	Королева Елизавета	+	+
11.	Айсберг	+	+
12.	Дева	+	+
13.	Первый приз	+	+
14.	Соня	+	+
15.	Рактангдха	+	++
16.	Ганга	+	+
17.	Арабская ночь	+	+
18.	Ландора	+	+
19.	Розовая пантера	+	+
20.	Мадхура	–	–
21.	Пуса вирангана	–	–
22.	Кешарский огонь	+	+
23.	Пуса манхар	+	+
24.	Ахилья	–	–
25.	Эйфелева башня	+	+
26.	Луизиана	–	–
27.	Пуса барамаси	–	–
28.	Сандигум сантинари	–	–
29.	Арджуна	+	+
+ выраженная реакция, ++ ярко выраженная реакция, – отрицательная реакция

ПРИМЕР 2

Получение антисывороток

Кроликов иммунизировали очищенным рекомбинантным белком оболочки PNRSV. Для получения гипериммунной сыворотки (антисыворотки после реиммунизации) против PNRSV использовали здоровых самцов (порода новозеландский альбинос) возрастом около 6 месяцев. Животным дважды вводили антиген в количестве примерно 100 мкг (на одну инъекцию), смешанный с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 внутримышечно и подкожно в бедро.

Первые два введения с полным адъювантом Фрейнда делались с интервалом 1 неделя. Второе и третье введения включали неполный адъювант Фрейнда (1:1) и делались также с недельным интервалом. Через две недели иммунизации у животных брали кровь из краевой вены уха. Кровь собирали в стеклянную пробирку и оставляли на 1 час при комнатной температуре для свертывания. Пробирку со свернувшейся кровью инкубировали при 4°С в течение ночи. Сыворотку отбирали пастеровской пипеткой и центрифугировали со скоростью 5000 об/мин в течение 10 мин при температуре 2-6°С. Супернатант сливали, добавляли азид натрия до концентрации 0,2% (по объему) и хранили при 4°С. Для получения сыворотки в большем количестве животных реиммунизировали через 5, 12, 16 и 22 недели после первой инъекции.

Для стандартизации и серологической проверки антисыворотку против PNRSV приобретали в фирме BioRad (USA).

Очистка антител (выделение иммуноглобулинов IgG из цельной сыворотки):

А) Путем осаждения сульфатом аммония:

1. К 1 мл неочищенной сыворотки добавляли 9 мл дистиллированной воды.

2. При постоянном перемешивании прибавляли по каплям 10 мл нейтрализованного насыщенного раствора сульфата аммония (Sigma).

3. Перемешав, оставляли при комнатной температуре примерно на 1 час, после чего раствор становился вязким и мутным вследствие выпадения в осадок антител (IgG).

4. Раствор центрифугировали со скоростью 9000 g в течение 15 мин и осадок промывали 2 мл PBS, разбавленного вдвое. Промывание повторяли трижды, чтобы удалить остатки сульфата аммония.

5. Последний осадок растворяли в 1 мл вдвое разбавленного PBS.

6. Измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм.

7. Раствор разбавляли до конечной концентрации антител 1 мг/мл (оптическая плотность 1,4 соответствует концентрации 1 мг/мл).

8. Аликвоты объемом 1 мл с азидом натрия (0,02% вес/объем) хранили при -20°С для дальнейшего использования.

Состав PBS (100 мл): 5,8 г Na₂HPO₄×12H₂O; 1 г NaH₂PO₄×2H₂O; 8,76 г NaCl

Б) С помощью аффинной хроматографии:

1. Колонку заполняли набухшей протеин А-сефарозой (Sigma).

2. Колонку промывали уравновешивающим буферным раствором.

3. Сыворотку разбавляли и пропускали через колонку с регулируемой скоростью.

4. Несвязавшиеся белки отмывали PBS до тех пор, пока они не переставали сходить с колонки (под спектрофотометрическим контролем).

5. Связавшийся белок (IgG) смывали элюирующим буферным раствором.

6. Доводили рН до нейтрального при помощи Tris-HCl.

7. Колонку регенерировали, промывая уравновешивающим буфером или буфером для хранения. Колонку хранили в последнем растворе при 4°С.

8. Элюат трижды подвергали диализу против PBS и хранили при -20°С до последующего использования.

Состав PBS (100 мл): 5,8 г Na₂HPO₄×12H₂O; 1 г NaH₂PO₄×2H₂O; 8,76 г NaCl

Уравновешивающий буфер (5-кратный): 0,05 М Tris; 0,15 М NaCl; рН 8,6.

Буфер для хранения: 0,05 М Na₂HPO₄; 0,05% Thomersol; рН 6,0.

Элюирующий буфер: 0,05 М CH₃COONa; 0,15 М NaCl; рН 4,5.

Получение конъюгатов антител с ферментом (щелочной фосфатазой)

1. Смешивали 1 мг препарата щелочной фосфатазы (Sigma) с 2 мл раствора очищенных антител.

2. К полученной смеси добавляли свежеприготовленный раствор глутарового альдегида (25% исходный раствор препарата, Merck) до конечной концентрации 0,05% и тщательно перемешивали.

3. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего она становилась коричневатой.

4. Центрифугировали 20 минут при 9000 g.

5. Осадок дважды промывали PBS (вдвое разбавленным), после чего разводили его в 2 мл PBS (вдвое разбавленного).

6. Чтобы полученный раствор лучше хранился, в него добавляли бычий сывороточный альбумин (BSA) до концентрации 5 мг/мл и азид натрия до концентрации 0,02% (вес/объем). Хранили при 4°С до последующего использования.

Оценка конъюгатов щелочной фосфатазы:

Активность конъюгатов определяли при помощи DAS-ELISA, как описано в примерах, приведенных в полной спецификации патента, используя известные образцы с положительной и отрицательной реакцией, и титрованием.

ПРИМЕР 3

Определение PNRSV из малины {Rubus spp.):

Для определения PNRSV были взяты два вида – Rubus ellipticus и Rubus navalis;

применялся DAS-ELISA, как описано выше. Образцы экстрагировали так же, как в случае розы (пример 1). Параллельно эти образцы анализировались при помощи стандартного диагностического набора DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen Gmbh, Germany); результаты суммированы в таблице 2.

Таблица 2
Результаты ELISA для разных видов Rubus spp. с применением стандартного диагностического набора и набора настоящего изобретения.
п/п	Культивар розы	ELISA с использованием стандартного набора	ELISA с использованием набора по изобретению
1.	Rubus ellipticus	+	++
2.	Rubus navalia	+	++
– + выраженная реакция, ++ ярко выраженная реакция, – отрицательная реакция

ПРИМЕР 4

Определение PNRSV из хмеля;

Для определения PNRSV с применением диагностического набора данного изобретения образцы хмеля анализировались при помощи DAS-ELISA, как описано выше. Экстракцию образцов проводили так же, как и экстракцию образцов розы в примере 1. Параллельно образцы анализировали при помощи стандартного диагностического набора DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen Gmbh, Germany); результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты ELISA для хмеля с применением стандартного диагностического набора и набора настоящего изобретения
п/п	Культивар хмеля	ELISA с использованием стандартного набора	ELISA с использованием набора по изобретению
1.	Humulus (хмель)	+	+

ПРИМЕР 5

Определение PNRSV из косточковых фруктовых деревьев и некоторых других культур:

Для определения PNRSV в косточковых фруктовых деревьях и некоторых цветоводческих и декоративных культурах образцы растительных тканей анализировались при помощи DAS-ELISA, как описано выше. Образцы экстрагировались, как в случае розы (см. пример 1). Параллельно эти образцы анализировались при помощи стандартного диагностического набора DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen Gmbh, Germany); результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4
Результаты ELISA для косточковых фруктовых деревьев и некоторых цветоводческих и декоративных культур с применением стандартного диагностического набора и набора настоящего изобретения
п/п	Культивар	ELISA с использованием стандартного набора	ELISA с использованием набора по изобретению
1.	Яблоня (сорт Гольден)	+	+
2.	Яблоня	+	+
3.	Peach cerasus	+	+
4.	Peach persica	+	+
5.	Peach (слива)	+	+
6.	Peach (миндаль)	+	+
7.	Begonia (бегония)	+	+
8.	Geranium (герань)	+	+
+ выраженная реакция, ++ ярко выраженная реакция, – отрицательная реакция

Преимущества настоящего изобретения

Основными преимуществами настоящего изобретения являются следующие:

1. Роза – одна из ведущих цветоводческих культур для срезки как в Индии, так и в других странах. Это растение в значительной степени поражено вирусом кольцевой пятнистости, который снижает жизненную силу растений. Поэтому было очень важно разработать способ отбора незараженного материала для размножения и селекции, т.е. создать надежный в местных условиях диагностический набор для определения вируса, позволяющий контролировать вирусную инфекцию.

2. Настоящий диагностический набор позволяет определять все штаммы PNRSV, включая индийские.

3. Настоящий диагностический набор, будучи местного производства, сравнительно дешевый.

4. Настоящий диагностический набор создан на основе поликлональных антител, так что он позволяет определять также другие штаммы PNRSV, заражающие другие культуры.

5. Настоящий диагностический набор позволяет определять PNRSV в цветоводческих культурах, а именно в розах (садовых, срезаемых на продажу, масличных), в диких растениях {Rubus spp.), (в косточковых фруктовых деревьях (яблоня, персик, слива, абрикос, миндаль, вишня), а также в некоторых других культурах (хмель, огурец, бегония и герань).

6. Компоненты набора могут использоваться для определения PNRSV в общем белке TCP сельскохозяйственных культур.

7. Компоненты данного набора могут использоваться в программах производства высококачественных растительных продуктов.

8. Компоненты данного набора могут использоваться в целях карантина растений.

9. Клонированный/синтезированный белок оболочки PNRSV может служить постоянным источником белка оболочки PNRSV для производства антител против PNRSV.

10. Компоненты данного набора дают лучший сигнал (как в случае розы и Rubus spp.) по сравнению со стандартным диагностическим набором.

11. Компоненты данного набора могут использоваться в эпидемиологических и прогностических целях.

12. Разработка данного набора дает средство более эффективного контроля за распространением вируса.

Формула изобретения

1. Диагностический набор для определения белка оболочки вируса кольцевой пятнистости слив (PNRSV), включающий:
а) поликлональные антитела против белка оболочки PNRSV в растениях, которые получены путем выделения поликлональных антител против белка оболочки PNRSV, очищенного из клеток хозяина, трансформированных геном белка оболочки PNRSV, амплифицированным с помощью заданных праймеров с последовательностью:
1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA,
2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC;
б) конъюгат поликлональных антител против белка оболочки PNRSV со щелочной фосфатазой;
в) буфер для сенсибилизации поверхности;
г) буфер для экстракции;
д) буфер ECI;
е) буфер PNP.

2. Способ определения PNRSV в растениях, включающий следующие стадии:
а) получение очищенного белка оболочки PNRSV путем амплификации гена белка оболочки PNRSV с помощью праймеров с последовательностью:
1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA,
2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC
с последующим клонированием полученного при этом гена в клетках хозяина, а затем очисткой белка оболочки из клеток хозяина;
б) получение поликлональных антител против белка оболочки PNRSV, полученного на стадии а);
в) проведение прямого твердофазного иммуноферментного анализа с прямыми антителами (DAS-ELISA) в исследуемом образце с помощью антител, полученных на стадии б), получая продукт для определения PNRSV.

3. Способ по п.2, в котором амплифицируется полный белок оболочки PNRSV из розы с помощью заданных праймеров с последовательностью:
1: прямой 5′-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA,
2: обратный 3′-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC.

4. Способ по п.2, в котором клонируется ген полного белка оболочки PNRSV с последовательностью 3:
MVCRICNHTHAGGCRSCKKCHPNDALVPLRAQQRVANNPNRMVCRICNHTHAGGCRSCKKCHPNDALVPLRAQQRVANNPNRNRNPNRVSSGMGPAVRPQPVVKTTWTVRGPNVPPRIPKGYYVAHNHREVMTTEAVKYLSIDFTTTLPQLMGQNLTLLTVIVRMNSMSSNGWIGMVEDYKVDQPDGPNALSRKGFLKDQPRGWQFEPPSDLDFDTFARTHRVVIEFKTEVPAGAKVLVRDLYVVVSDLPRVQIPTDVLLVDEDLLEI в векторе pGEX-2TK, после чего проводится трансформация штамма E.coli BL 21.

5. Способ по п.2, в котором полученный на стадии б) белок оболочки PNRSV подвергается проверке на оптимальную экспрессию при концентрации IPTG в 0,5-0,9 мМ при температуре 30°С в течение 3-3,5 ч.

6. Способ по п.2, в котором для получения поликлональных антител против белка оболочки PNRSV трижды с интервалом в 1 неделю проводится иммунизация кроликов очищенным белком оболочки PNRSV, полученным на стадии 2а), в полном адъюванте Фрейнда в соотношении 1:1.

7. Способ по п.6, где иммунизация проводится внутримышечно, подкожно или внутривенно.

8. Способ по п.6, в котором у кроликов берут кровь через 14-15 суток, после чего проводят очистку поликлональных антител против белка оболочки PNRSV из сыворотки.

9. Способ по п.2, в котором для проведения анализа лунки микропланшета стабилизируют поликлональными антителами, после чего вносят исследуемый образец, а затем конъюгат поликлональных антител против белка оболочки PNRSV со щелочной фосфатазой.

10. Способ по п.9, в котором для проведения анализа лунки микропланшета стабилизируют поликлональными антителами в стабилизирующем буфере в разведении 1:500-1:1000, после чего промывают 4-5 раз PBS-T.

11. Способ по п.9, в котором исследуемые образцы получают путем обработки зараженной ткани листьев из растения экстракционным буфером с последующим разведением исходного антигена в 1-1/160 раз перед внесением в лунки микропланшета.

12. Способ по п.11, в котором микропланшет инкубируют в течение ночи при 37°С, а затем промывают, что обеспечивает связывание антигена в лунках.

13. Способ по п.9, в котором для проведения анализа антитела против белка оболочки PNRSV конъюгируют со щелочной фосфатазой, получая конъюгат поликлональных антител против белка оболочки PNRSV со щелочной фосфатазой, который добавляют в буфер ECI в соотношении 1:500-1:1000 и вносят в лунки микропланшета, который инкубируют в течение примерно 4 ч при 37°С, а затем промывают PBS-T.

14. Способ по п.13, в котором в лунки микропланшета добавляют по 100 мкл раствора n-нитрофенилфосфата в концентрации 1 мг/мл в буфере PNP.

15. Способ по п.9, в котором реакцию останавливают добавлением 50 мкл 3М NaOH через 15-20 мин, получая продукт желтого цвета.

16. Способ по п.15, в котором окрашенный продукт представляет собой конъюгат антиген-антитело.

17. Способ по п.15, в котором для определения вируса кольцевой пятнистости слив измеряется поглощение окрашенного продукта при 405 нм.