Патент на изобретение №2398597

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА БРУЦЕЛЛ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для профилактики бруцеллеза, в частности к способам получения протективных антигенов. Способ предусматривает выращивание бактериальной массы на твердой питательной среде. Полученную бактериальную массу отмывают от балластных веществ физиологическим раствором и центрифугируют при 6 тыс.об./мин в течение 30 минут. После чего бактериальную массу ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 1:5. Подготавливают раствор, содержащий щелочь и поликатион, в качестве которого используют N-N-диметил N-N-диаллиламмония хлорид в равных объемах. Полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором и выдерживают при температуре 2-6°С. Полученную взвесь промывают дистиллированной водой, после чего центрифугируют при 6 тыс. оборотов в течение 30 мин. Изобретение позволяет получить соединение с высокой иммуногенностью, не осложняющее диагностику бруцеллеза. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения протективных антигенов, и может быть использовано для специфической профилактики и оздоровления животных от бруцеллеза.

Известны способы получения специфических средств защиты животных от возбудителя бруцеллеза – живых вакцин из штаммов В.abortus 19 и В.abortus 82, включающие культивирование бруцелл вакцинных штаммов на питательной среде с последующим сбором микробных клеток, ресуспендирование и лиофильное их высушивание. Применение живых вакцин позволяет профилактировать заболевание бруцеллезом. Однако использование живых вакцин опасно из-за длительного бактерионосительства, возможности проявления остаточной вирулентности у иммунодефицитных и ослабленных особей, а также у взрослых животных, не вакцинированных в раннем возрасте. Вследствие длительных поствакцинальных гуморальных реакций (позитивные серореакции – РА, РСК и др.) снижается эффективность диагностических мероприятий, так как требуется применение дополнительных дифференциальных тестов (РИД с ОПС-антигеном и др.) Неоднократное применение живых вакцин способствует развитию патоморфологических изменений.

Известен способ получения протективного защитного антигена бруцелл (см. патент 2915437, НКИ 424-92, опубл. 11 мая 1956 г.). Испытание иммуногенной фракции в смеси с поликатионом показало ее выраженное профилактическое действие. Антиген бруцелл получают воздействием на бруцеллы углекислого натрия в интервале рН от 7 до 11 в течение нескольких суток при температуре 2°C с замораживанием-оттаиванием. Выделение антигена проводят фильтрованием через фильтр Зейтца. Готовый антиген используют в смеси с поликатионом (поливинилпирролидоном). Однако препарат не нашел применения в ветеринарной практике из-за длительности и сложности технологии приготовления.

Задачей изобретения является получение протективного антигенного комплекса бруцелл с высокой иммуногенностью и профилактическими свойствами, не осложняющего диагностику бруцеллеза.

Задача решается следующим образом: выращивают бактериальную массу на твердой питательной среде, которую отмывают физиологическим раствором от балластных веществ, при 6 тыс.об/мин в течение 30 минут, бактериальную массу ресуспендируют в соотношении 1:5 дистиллированной водой, полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатиона, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, в качестве поликатиона используют поли-N,N-диметил-N-N-диаллиламония хлорид, полученный бактериальный комплекс выдерживают при t 2-6°C, несвязавшийся поликатион и щелочь отмывают десятикратным объемом дистиллированной воды, полученную взвесь центрифугируют при 6 тыс.оборотов в течение 30 мин.

Отличительными признаками предлагаемого способа являются: центрифугирование проводят при 6 тыс.об/мин в течение 30 мин, предлагаемый режим позволяет полностью отделить бруцеллы от балластных веществ. Ресуспендирование бактериальной массы дистиллированной водой в соотношении 1:5, такое соотношение обеспечивает максимальный выход антигена из бруцелл. Полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатиона, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, щелочь обеспечивает стерильность и инактивацию бруцелл, а использование в качестве поликатиона поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорида способствует созданию прочного протективного антигенного комплекса бруцелл с высокой иммуногенностью, полученную взвесь центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 минут.

Использование щелочи вместо углекислого натрия (см. патент 2915437) позволяет в течение суток без замораживания-оттаивания полностью инактивировать бруцеллы. Одновременное экстрагирование антигена и конъюгация его с полокатионом поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония создает более прочный иммуногенный комплекс, который уменьшает выработку агглютининов. При использовании известного способа агглютинация меняет лишь характер получения преципитата.

Поликатион поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорид является высокомолекулярным, более 200 килодальтон, высокоэпитопным водорастворимым полимером. При конъюгировании создает прочные комплексы с многими химическими веществами, в том числе и с протеин-полисахаридами бруцелл.

Полученный протективный антигенный комплекс бруцелл обладает высокой иммуногенностью (до 100%) и профилактическими свойствами, не вызывает длительного проявления поствакцинальных специфических к бруцеллам антител, следовательно, не осложняет диагностику бруцеллеза.

ПРИМЕР

Протективный антигенный комплекс бруцелл получают следующим образом: выращивают бактериальную массу В. abortus 19 или штамма В. abortus 544 на твердой питательной среде, которую отмывают физиологическим раствором от балластных веществ, центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 минут, бактериальную массу ресуспендируют в соотношении 1:5 дистиллированной водой, клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатиона, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, в качестве поликатиона используют поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорид, полученную бактериальную взвесь выдерживают при t 2-6°C, несвязавшийся поликатион и щелочь отмывают десятикратным объемом дистиллированной воды, взвесь центрифугируют при 6 тыс.оборотов в течение 30 мин.

Таблица 1
Очистка бактериальной массы от балластных веществ
п/п	Режимы центрифугирования	Наличие бруцелл в натате тыс. микроб, клеток
1	3 тыс., 30 мин.	100
2	6 тыс., 30 мин.	0
3	6 тыс., 60 мин.	0

Из таблицы 1 видно, что режим центрифугирования 3 тыс.об/мин в течение 30 минут является недостаточным для полного осаждения бруцелл из бактериальной массы. Режим 6 тыс.об/мин в течение 30 минут является оптимальным и позволяет максимально отделить бруцеллы от балласта.

Таблица 2
п/п	Ресуспендирование полученной бактериальной массы с водой проводили при следующих соотношениях:
Соотношение бак. массы с дистиллированной водой	Выход антигена (%)
1	1:2	40-50
2	1:5	80
3	1:10	70

Из таблицы 2 видно, что соотношение бактериальной массы с дистиллированной водой 1:5 является оптимальным так, как обеспечивает максимальный выход антигена (80%).

Катион подбирали по прочности связи с антигеном, которую проверяли с помощью электрофореза, по диффузии антигена, чем ниже диффузия, тем прочнее связь с поликатионом. При этом учитывали иммуногенные свойства полученного антигенного комплекса, иммуногенность проверяли на морских свинках.

Таблица 3
Выбор полииона для создания протективного антигенного комплекса бруцелл
пп	Полиионы	Подвижность антигенов при электрофорезе	иммуногенность животных (%)
1	Поливинилпирралидон	положительно	100
2	поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорида	отрицательно	100
3	Полиакриловая кислота	положительно	60

Из таблицы 3 видно, что антиген в связи с поливинилпирралидоном проявляет диффузию (подвижен), обладая высокой иммуногенностью (до 100%), с полиакриловой кислотой также подвижен, иммуногенность – 60%, с поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлоридом создает прочные ионные связи и обладает 100% иммуногенностью.

Таким образом, предлагаемый способ полученя антигенного комплекса бруцелл, основанный на культивировании бруцелл вакцинного штамма 19 с последующим разрушением клеток щелочным гидролизом с одновременной конъюгацией с поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлоридом, позволяет получить прочный с высокой иммуногенностью комплекс (до 100%), профилактическими свойствами, не осложняющий диагностику бруцеллеза.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

2. Патент 1518961 Способ получения вакцины против бруцеллеза. Петров Р.В., Хаитов P.M., Игнатов П.Е., Некрасов А.В., Свиридов В.Д., Федоров А.И., Горяинов Д.А., Сочнев В.В., Григорьева Г.И. – 05.12.1985.

3. Шин Н.Г. и др. Иммунологическая характеристика клеточных компонентов бруцелл / Шин Н.Г., Ременцова М.М., Студенцов В.К., Цирельсон Л.Е., Цой В.П. / ЖМЭИ, 1984. – 10. – С.92-96.

5. Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения бруцеллезного антигена. Авт. св-во 12565258 СССР, А61К 39/10.

6. Химические противобруцеллезные вакцины: Франция, 1982.-2506615 А61К 39/10, Израиль, 1985. – 4493825 А61К 39/10, WO, 1984. – 84/01289 А61К 39/10

Формула изобретения

Способ получения протективного антигенного комплекса бруцелл, включающий выращивание бактериальной массы на твердой питательной среде, отмывание физиологическим раствором от балластных веществ, центрифугирование, ресуспендирование, смешивание, полученную смесь выдерживают при температуре 2-6°С, отличающийся тем, что центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 мин, ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 1:5, полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатионом, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, в качестве поликатиона используют поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорид, полученную взвесь центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 мин.