Патент на изобретение №2398377

(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЫШЕЙ ИНБРЕДНОЙ ЛИНИИ AKR/JY

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Выделенную из тушки мыши селезенку, имеющую температуру тела 38±1°С, очищают от соединительнотканной капсулы и гомогенизируют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 24,0±1,0°С. Затем суспензию клеток фильтруют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 15,0±2,0°С, и разбавляют им до концентрации от 1×10⁶ до 1×10⁷ кл/мл. После этого к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденный до 4,0±2,0°С. Разливают в ампулы для замораживания и выдерживают при температуре 4±2°С от 15 до 30 минут. После температурной выдержки охлажденные клетки замораживают и хранят в электроморозильнике с температурой от -70° до -196°С. Сохранность биологических свойств размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки лейкозных клеток. Изобретение может быть использовано для повышения сохранности биологических свойств лейкозных клеток вне организма доноров – мышей инбредной линии AKR/JY на этапах выделения и замораживания клеточной суспензии. 1 табл.

Предлагаемое техническое решение относится к области медицины, в частности к способам консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY, которые представляют собой биологические модели лейкозов человека. Применение в экспериментальных исследованиях технологии консервирования перевиваемых лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY, позволит получить у здоровых животных в любое время необходимый вариант не только спонтанного сингенного лимфоидного, но и других подвидов лейкозов, что существенно расширит ограниченные возможности ученых в изучении вопросов этиологии, патогенеза и терапии тяжелых злокачественных заболеваний. Основным критерием оценки эффективности способа консервирования лейкозных клеток является определение у них сохранности биологических свойств, т.е. способности воспроизвести определенный подвид спонтанного лейкоза.

Известен способ выделения перевиваемых лейкозных клеток из селезенки мышей инбредной линии (см. Раушенбах М.О. Экспериментальные исследования лейкозов. М.: Медгиз, 1956, с.99-112). Недостатком данного способа является невозможность сохранять специфические биологические свойства перевиваемых лейкозных клеток вне организма мыши при комнатной температуре от 18 до 25°С в течение длительного времени.

Известен способ выделения клеток из селезенки мышей инбредных линий с температурой тела 38±1°С путем последовательного выполнения асептической спленэктомии, декапсуляции селезенки, измельчения ее пульпы, гомогенизации фрагментов пульпы и фильтрации лейкозных клеток гомогенизата на льду в стерильном физиологическом растворе, после чего производят смешивание фильтрата с криоконсервантом, замораживание суспензии клеток и хранение их при температуре от -70° до -196°С (Практикум по иммунологии: Учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / И.А.Кондратьева [и др.]. – 2-е изд., испр. и. доп. – М.: Издательский центр «Академия», 2004. – 272 с.). Этот способ является наиболее близким техническим решением к предлагаемому. Недостатком известного способа является то, что применяемые для сохранности биологических свойств перевиваемых лейкозных клеток вне организма животного искусственная охлажденная внеклеточная среда из стерильного физиологического раствора и температурные условия губительны для части перевиваемых клеток. Среда считается не оптимальной для лейкозных клеток, поскольку не обладает свойствами криоконсерванта и приводит к отрицательному результату перевивки определенного подвида лейкоза в 20-30% случаев экспериментов.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение максимальной сохранности специфической функциональной полноценности перевиваемых консервированных лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY.

Целью предлагаемого изобретения является повышение сохранности биологических свойств лейкозных клеток вне организма доноров-мышей инбредной линии AKR/JY.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе выделения лейкозных клеток из селезенки мышей с температурой тела 38±1°С, включающем асептическую спленэктомию, декапсуляцию селезенки, измельчение ее пульпы, гомогенизацию фрагментов пульпы и фильтрацию лейкозных клеток гомогенизата в искусственной охлажденной внеклеточной среде, последующее смешивание фильтрата с криоконсервантом, замораживание и хранение суспензии клеток при температуре от -70° до -196°С, декапсуляцию, измельчение пульпы и гомогенизацию фрагментов пульпы селезенки производят в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 24,0±1,0°С, фильтрацию лейкозных клеток выполняют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 15,0±2,0°С, которым суспензию клеток разбавляют до концентрации от 1×10⁶ до 1×10⁷ кл/мл, к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденном до 4,0±2,0°С, разливают в ампулы для замораживания и выдерживают при температуре 4±2°С от 15 до 30 минут, после температурной выдержки клетки замораживают и хранят в электроморозильнике. Сохранность размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки лейкозных клеток.

Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как в процессе проведения патентно-информационных исследований не выявлено источников информации, порочащих новизну предлагаемого способа.

Предлагаемый способ заключается в асептическом выделении лейкозных клеток из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY, поэтапном охлаждении температуры клеток, замораживании и хранении их при температуре от -70° до -196°С. Поэтапное снижение температуры клеток от температуры тела животного 38±1°С до 24,0±1,0°С, затем 15,0±2,0°С и 4,0±2,0°С вне организма проводится в искусственной внеклеточной среде – лечебном препарате для инфузий «Полиглюкин», который представляет собой 6% раствор декстрана с молекулярной массой от 50000 до 70000 и обладает свойствами клеточного криоконсерванта (Криоконсерванты / Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. – К.: Наук. думка, 1974. – 200 с., стр.73-77). Последующее замораживание, хранение клеток при -70° или -196°С и размораживание повышают сохранность биологических свойств лейкозных клеток и способность к перевиванию определенного подвида спонтанного лейкоза.

Экспериментальные исследования выполнены на базе ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий».

Эффективность способа проверена в ряде опытов на мышах инбредной линии AKR/JY на высоте заболевания. Сравнительные с прототипом результаты представлены в таблице.

Выводы.

Предлагаемый способ консервирования обеспечивает сохранность биологических свойств лейкозных клеток и позволяет использовать их для моделирования сингенных лейкозов мышей инбредной линии AKR/JY.

Пример.

Способ осуществляют в асептических условиях в стерильной маске, стерильных перчатках, стерильными глазными хирургическими инструментами (ножницы, пинцеты, скальпели), на стерильном препаровальном столике с иглами, с использованием стерильного гомогенизатора тканей, 4-слойного капронового фильтра, стерильной конической пробирки объемом 10 мл, электрических морозильников на 4,0±2,0°С, -70±2,0°С (или сухая углекислота) и -196±2,0°С, флакона объемом 400 мл с лечебным препаратом для инфузий «Полиглюкин» с системой для переливания крови, кровезаменителей и инфузионных растворов, к которому подведена вода с изменяемой температурой от 24,0±1,0°C до 15,0±2,0°С, флакона объемом 50 мл стерильного раствора криоконсерванта, охлажденного до 4,0±2,0°С и ампул объемом 5-10 мл для замораживания клеток селезенки.

После усыпления (эфир, хлороформ) половозрелой мыши (массой 18-22 г, температурой тела 38±1°С) с развитым лейкозом (от 4 до 10 мес. от начала опыта) тушку кладут на препаровальный столик на правый бок, фиксируют к столику стерильными иглами, затем обрабатывают левый бок спиртом. В районе «талии» животного ножницами делают поперечный разрез кожи длиной 2-2,5 см слева от середины туловища, затем разрез мышц, пинцетом извлекают из брюшной полости селезенку темно-бордового цвета массой 700±300 мг, отрезают ее соединительные тяжи и помещают в стерильную чашку Петри, в которую по полимерной магистрали поступает препарат «Полиглюкин» из стеклянного флакона, охлажденный проточной водой до 24,0±1,0°С. В этих условиях селезенку освобождают от остатков соединительной ткани (декапсулируют), после чего пульпу селезенки ножницами фрагментируют на мелкие кусочки и гомогенизируют. Гомогенизат фильтруют через один или два стерильных капроновых 4-слойных фильтра в пробирку, в которые по полимерной магистрали поступает препарат «Полиглюкин» из стеклянного флакона, охлажденный проточной водой до 15,0±2,0°С, и разбавляют им до концентрации от 1×10⁶ до 1×10⁷ кл/мл. После этого к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденный в электроморозильнике до 4,0±2,0°С, разливают в ампулы для замораживания, герметизируют и выдерживают в электроморозильнике при температуре 4±2°С от 15 до 30 минут. После температурной выдержки охлажденные клетки переносят в электроморозильник, замораживают и хранят при температуре -70°С в течение года, при -196°С в течение несколько лет. Размораживание клеток производят путем погружения ампул в водяную баню и их интенсивного покачивания в ручном режиме при температуре 39-41°С до согревания суспензии лейкозных клеток до 37°С. Сохранность размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки заданного подвида спонтанного лейкоза.

Таблица
Сравнительные результаты сохранности биологических свойств перевиваемых лейкозных клеток селезенки мышей инбредной линии AKR/JY
пп.	Вид лейкоза	Результат перевивки выделенных лейкозных клеток селезенки
Способ-прототип	Заявленный способ
1.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
2.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
3.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
4.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
5.	В-клеточный лимфобластный лейкоз	В-клеточный лимфобластный лейкоз	В-клеточный лимфобластный лейкоз
6.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
7.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
8.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
9.	миелобластный лейкоз	отрицательный	отрицательный
10.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
11.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
12.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	отрицательный
13.	миелобластный лейкоз	миелобластный лейкоз	миелобластный лейкоз
14.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
15.	пролимфоцитарный лейкоз	отрицательный	пролимфоцитарный лейкоз

Проведенные исследования показывают, что из 15 случаев параллельной перевивки сингенного лейкоза положительные результаты при использовании прототипа получены в 8 случаях, тогда как применение предложенного способа дало положительные результаты в 13 случаях.

Предлагаемая технология консервирования лейкозных перевиваемых клеток инбредных мышей в установленных стандартах технологии проста в реализации, дает стабильный положительный результат и может быть использована в учреждениях медицинского и биологического профиля в экспериментальных исследованиях лейкозов для сохранности биологических свойств перевивных лейкозных клеток.

Формула изобретения

Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY с температурой тела 38±1°С, включающем асептическую спленэктомию, декапсуляцию селезенки, измельчение ее пульпы, гомогенизацию фрагментов пульпы и фильтрацию лейкозных клеток гомогенизата в искусственной охлажденной внеклеточной среде, последующее смешивание фильтрата с криоконсервантом, замораживание суспензии клеток и хранение их при температуре от -70 до -196°С, декапсуляцию, измельчение пульпы и гомогенизацию фрагментов пульпы селезенки производят в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 24,0±1,0°С, фильтрацию лейкозных клеток выполняют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 15,0±2,0°С, которым суспензию клеток разбавляют до концентрации от 1·10⁶ до 1·10⁷ кл/мл, к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденный до 4,0±2,0°С, разливают в ампулы для замораживания и выдерживают при температуре 4±2°С от 15 до 30 мин, после температурной выдержки клетки замораживают и хранят в электроморозильнике, сохранность размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки лейкозных клеток.