Патент на изобретение №2398290

(54) СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПАРЕНХИМЫ ПОВРЕЖДЕННОЙ ПЕЧЕНИ КРЫС

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной гепатологии, и касается восстановления паренхимы поврежденной печени крыс. Для этого осуществляют введение микроэлементного препарата «Сувар» в количестве 45-50 мг/кг массы и трепел в количестве 1,25-1,3 мг/кг. Введение осуществляют один раз в сутки с основным рационом. Способ обеспечивает стимуляцию пролиферативной активности гепатоцитов и, как следствие, эффективное восстановление паренхимы печени после повреждений различной этиологии. Полученные результаты позволяют рекомендовать способ для использования в регенеративной терапии повреждений печени в клинике. 6 табл.

Изобретение относится к области медицины и касается способов восстановления паренхимы печени после травматических травм печени и может быть использовано в клинике для регенерационной терапии при паталогии печени.

Одной из актуальных проблем гепатологии являются травматические повреждения печени. По сведениям ряда авторов, повреждения печени в настоящее время колеблются от 20% до 90% всех травм брюшной полости и не имеют тенденции к снижению. Досмамбетова К.К. Морфология роли печени и реакция регионарных лимфатических узлов при применении геля “Луросом”. Дис. канд. мед. наук, Новосибирск. 2004, с.128. Кроме того, после оперативного вмешательства у части пациентов развиваются воспалительные осложнения.

Несмотря на успехи в области гепатологии, лечение травм печени остается недостаточно эффективным. Исторически в подходах к терапии патологии печени существовало две точки зрения. Ранее усилия исследователей преимущественно были направлены на ликвидацию воспалительной инфильтрации в строме органа, то есть наибольшее значение придавалось подавлению агрессивности соединительной ткани, развивающейся в печени. В настоящее время большинством авторов приорететным считается нормализация структуры паренхимы печени; накоплены факты, свидетельствующие о том, что интенсивная регенераторная пролиферация гепатоцитов приводит как к восстановлению собственно паренхимы органа, так и оказывает влияние на состояние соединительной ткани, не только тормозя ее развитие, но и вызывая ее резорбцию.

Известны терапевтические способы для стимуляции регенерации печени, а именно введение в организм препарата хориогонин (Солопаев Б.П. Регенерация нормальной и патологически измененной печени. Горький, 1980, с 239), лохеина (Саратиков Л.С. Гепатопротективные свойства лохеина / Саратиков Л.С. и др. Растительные ресурсы, 2004, т.40, 4, с.462-465). Также наблюдается активация регенерации печени мышей после введения им гепатотоксинов при трансплантации костного мозга. Эти способы повышают пролиферативную активность гепатоцитов, однако полного востановления первоначальной структуры органа не происходит.

Известен способ стимуляции регенерации печеночной ткани путем подкожного введения экспериментальным животным вытяжки коры свиных или фетальных (человеческих) надпочечников в дозе по 0,5 мл в количестве двух инъекций. Способ повышает эффективность регенерации печеночной ткани и восстановление паренхимы патологически измененной печени с одновременным снижением побочных эффектов от применяемого синтетического лекарственного средства. RU 2134582 6 A61K 35/55, A61K 31/56.

Известен способ восстановления паренхимы патологически измененной печени крыс, включающий введение гонадотропина хорионического с одновременным введением мидийного гидролизата пищевого. При этом гонадотропин хорионический вводят один раз в день в дозе 75 ЕД – 85 ЕД на 100,0 массы тела в 1, 2, 3, 9, 10 и 11 дни после начала введения, введение осуществляют через зонд в желудок по 3 мл 33% водного раствора один раз в день 4 дня подряд, потом 2 дня перерыв с трехкратным повторением этого курса. RU 2077739 6 С09В 23/28. 1997.04.20.

Однако при использовании данных способов полного восстановления паренхимы печени не происходит.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа восстановления паренхимы поврежденной печени крыс.

Технический результат заключается в повышении эффективности восстановления поврежденной паренхимы печени с одновременным снижением побочных эффектов.

Это достигается тем, что способ восстановления паренхимы поврежденной печени крыс, включающий введение биологически активного препарата, согласно изобретению в качестве биологически активного препарата используют микроэлементный препарат «Сувар» в количестве 45-50 мг/кг массы и трепел в количестве 1,25-1,3 мг/кг массы, введение осуществляют один раз в сутки с основным кормом.

Трепел – карбонатно-кремниевая цеолитсодержащая порода Первомайского месторождения Алатырского района Чувашской Республики, содержащий, %: оксид кремния – 60,3-72,5; оксид железа – 2,8-4,2; оксид алюминия – 8,4-10,1; оксид кальция – 2,6-12,3; оксид магния – 0,9-1,3; оксид натрия – 0,18-0,29; оксид калия – 1,4-1,5.

Из микроэлементов в трепелах содержатся: медь – 300 мг/кг, молибден – 25 мг/кг, фтор – 90 мг/кг, марганец 510 мг/кг, фосфор – 3900 мг/кг. Тяжелые металлы (мышьяк, кадмий, ртуть) не содержатся.

Смесь солей терпенойдов (смоляных кислот) (в дальнейшем препарат «Сувар») представляет собой аморфный порошок светло-серого цвета с общей формулой (С₁₉Н₂₉СОО)Me, где Me – ионы: Fe⁺²; Cu⁺²; Zn⁺²; Mn⁺²; Co⁺². «Сувар» не имеет запаха, плотность при 20°С в пределах 0,55-0,6 г/см³. Кислотное число 0-10 мг KOH, нерастворим в воде, растворим в маслах и органических растворителях, не токсичен, малоопасен (IV класс опасности).

Пример. Способ восстановления паренхимы поврежденной печени крыс осуществлялся следующим образом: для этого в эксперименте были использованы две группы животных. Одна группа была представлена 18 беременными самками крыс, которым на 17-18 день беременности после вскрытия брюшной полости стальной иглой с ограничителем выполняли прокол стенки матки, плодного пузыря, а затем и передней брюшной стенки плодов в месте проекции печени. После операции часть плодов извлекали из матки в результате релапаротомии (на 1-3 сутки), часть животных рождалась самостоятельно. Животных выводили из эксперимента эфиром в сроки 1, 3, 5, 9, 11, 15, 20 и 30 суток после операции. Наличие повреждения печени контролировалось гистологически. Всего было получена печень от 64 оперированных плодов. В качестве контроля были взяты 36 плодов и новорожденных крысят.

Вторая экспериментальная группа была представлена 48 крысятами 18-дневного возраста, которым под эфирным наркозом проводился прокол передней брюшной стенки в месте проекции печени. Выведение животных из эксперимента производилась в те же сроки, что и у животных первой группы. Контролем служили 36 крысят того же возраста, что и опытные животные.

В обеих группах ряду животных прокол был осуществлен с помощью иглы от шприца, на конец которой надевали резиновый баллончик. С помощью этого приспособления нескольким животным в обоих группах вводили незначительное количество туши для маркировки участка повреждения.

Начиная с первых дней и до конца эксперимента часть опытных животных к основному рациону получала трепел из расчета 1,25 мг/кг и «Сувар» – 50 мг/кг.

Другая часть опытных животных получала 1,3 мг/кг трепела и 45 мг/кг “Сувара”.

Гистологическое исследование проводили на гистотопографических парафиновых срезах толщиной 5-6 мкм, окрашенных гематоксилином с докраской эозином, по ван Гизону и по Фельгену. Митозы и двуядерные и двуядрышковые геатоциты подсчитывали на 7000 клеток. Количество ДНК в гепатоцитах определяли в световом микроскопе Биолам – 70 фотометрированием с использованием микрофотонасадки ФМЭЛ-1 и фотометра ФЭУ-1А в проходящем свете с запирающим светофильтром с максимумом светопропускания на длине волны 570 нм при напряжении 900 В. Диплоидным эталоном служили лимфоциты периферической крови и малые лимфоциты лимфатических узлов.

В контрольных группах на месте повреждения в 1 сутки определялся участок некроза гепатоцитов. У животных, оперированных внутриутробно на 2-3 сутки вокруг очага травмы возникала мезенхимальная клеточная реакция, которая на 5-6 сутки становилась преимущественно фибробластической. На 9-11 сутки и позднее на месте очага повреждения обнаруживалась соединительная ткань, которая сохранялась здесь до конца эксперимента. У новорожденных животных второй группы заживление протекало по аналогии с тем, что имело место у оперированных плодов, однако имелись и некоторые различия. Так, мезенхимальная реакция вокруг очага повреждения была выражена в большей степени, а фибробластическая реакция наступала у них несколько позднее (на 6-7 сутки после операции). Развитие соединительной ткани обнаруживалось на 11-15 сутки, а на месте повреждения развивался участок соединительной ткани визуально (и при компьютерной обработке срезов) больший по размерам, чем у внутриутробно оперированных животных.

В опытных группах и у оперированных животных во внутриутробном периоде, и у оперированных новорожденных крысят вокруг очага повреждения на 2-3 сутки появлялось небольшое количество молодых мезенхимальных клеток. Количество их по мере увеличения срока после операции не возрастало; на 5-6 сутки (у оперированных во внутриутробном периоде) и на 6-7 сутки (у новорожденных) вокруг очага некроза обнаруживались буквально единичные клетки типа фибробластов; одновременно визуально отмечалось явное уменьшение очага повреждения, что также фиксировалось при компьютерной обработке срезов. На 9 сутки у части животных оперированных во внутриутробном периоде и на 11 сутки у части оперированных новорожденных крысят в гистотопографических срезах обнаруживался незначительный по величине участок нежной соединительной ткани. В ряде гистотопографических препаратах (у оперированных во внутриутробном периоде в 32% случаев, у новорожденных крысят в 26% случаев) очагов соединительной ткани не определялось, что давало основание предполагать о полном восстановлении структуры печени. В единичных случаях для маркировки участка повреждения в этот участок с помощью иглы от шприца вводили небольшое количество туши. При гистологическом исследовании гистотопографических срезов эти участки определялись в виде капель черного цвета; при этом в этих местах препаратов или совершенно отсутствовала соединительная ткань, или же участок соединительной ткани был ничтожно мал.

Морфометрическое исследование установило резкую активацию регенераторных процессов в печени, проявляющихся пролиферацией гепатоцитов, у экспериментальных животных по сравнению с контролем. Отмечена полиплоидизация печеночных клеток, значительное повышение количества митозов и резкое увеличение числа двуядерных гепатоцитов (см. таблицы).

Таблица 1
Число митозов у животных первой и второй группы по сравнению с контролем в
Время после операции (сутки)	Первая экспериментальная группа	Вторая экспериментальная группа
Опыт М±м	Контроль М±м	Опыт М±м	Контроль М±м
1	1,4±0,3	1,1±0,4	0,9±0,4	1,0±0,2
3	6,9±0,7*	4,9±2,3	4,2±0,9	3,2±0,9
5	8,2±2,2 *	4,1±2,4	5,3±2,6*	4,3±2,1
9	7,6±3,1*	2,3±0,8	6,9±2,8*	3,5±0,6
11	2,2±0,6	–	1,6±0,7	–
p<0,001

Таблица 2
Число двуядерных гепатоцитов животных первой и второй группы по сравнению с контролем в
Время после операции (сутки)	Первая экспериментальная группа	Вторая экспериментальная группа
Опыт М±м	Контроль М±м	Опыт М±м	Контроль М±м
1	14,6±2,8	15,4±3,6	12,9±1,9	14,5±2,7
3	12,4±1,9	15,3±2,7	13,5±2,8	13,6±3,1
5	17,4±3,7	16,6±2,5	15,3±2,5	14.6±2,8
9	35,6±6,4*	26,3±5,4	29,1±3,7*	24,7±4,5
11	37,2±7,3*	28,1±4,6	32,7±5,4*	27,2±6,4
15	34,5±4,7*	28,1±5,3	31,8±4,6*	25,4±3,8
20	32,8±6,3*	26,5±4,7	32,7±4,5*	27,3±4,5
30	31,9±6,3*	27,4±5,2	33,6±5,6*	24,5±3,8
p<0,001

Таблица 3
Плоидность ядер гепатоцитов у животных первой и второй группы в %
Время после операции (сутки)	Первая экспериментальная группа опыт	Вторая экспериментальная группа опыт
Диплоидные ядра	Тетраплоидные ядра	Диплоидные ядра	Тетраплоидные ядра
74,6	25,4	65,4	34,6
1	69,1	30,9	65,6	34,4
3	40,9	58,3	36,5	62,8
5	34,6	64,6	28,3	69,2
9	39,2	59,1	30,8	67,3
11	53,6	45,4	49,1	48,1
15	68,5	31,4	73,6	26,3
20	64,5	35,5	69,1	30,9
30

Примечание: на 5-20 сутки в препаратах также обнаруживались в небольшом % случаев 8-плоидные и 16-плоидные ядра гепатоцитов.

Пример 2. Восстановление паренхимы печени крыс осуществляли следующим образом: были использованы экспериментальная группа животных и опытная. В первой группе было задействовано 43 половозрелых самок крыс, опытную группу составили 40 самок крыс аналогичного возраста. Вес экспериментальных животных колебался от 273 до 284 грамм, у контрольных – от 270 до 290 грамм. Животным обоих групп на протяжении 180 суток вводили четыреххлористый углерод в виде 66% масляного раствора (на стерильном оливковом масле) 0,1-0,2 мл подкожно в область передней брюшной стенки 2 раза в неделю. Контрольные животные получали основной рацион, опытным животным начиная с первых дней эксперимента к основному рациону добавляли препараты «Трепел» из расчета 1,3 мг/кг и «Сувар» – 45 мг/кг. Животных выводили с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». После вскрытия крыс извлекали печень, из нее вырезали кусочки размерами 1×1 см. После фиксации в 10% нейтральном формалине готовили парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону и по Фельгену. Срезы нативной печени, полученные на криостате, окрашивали Суданом Ш. Сукцинатдегидрогеназу и КАЭН-диафоразу определяли тетразолиевым методом по З.Лойда, Р.Госсрау и Т.Шиблер (1982). Кислую фосфатазу определяли методом сочетания с фосфатами нафтолов-А8 и стабильными солями диазония; щелочную фосфатазу – по методу Барстона (З.Лойда, Р.Госсрау, Т.Шиблер, 1982). Уровень активности ферментов оценивали количественно фотометрированием в проходящем свете на микроскопе «Микромед-2» с использованием фотонасадки ФМЭЛ-1. Гликоген выявляли с помощью ШИК-реакции с контролем амилазой (Г.А.Меркулова, 1969). Для количественного определения ДНК в ядрах гепатоцитов срезы исследовали в световом микроскопе Биолам-70 с использованием микрофотонасадки ФМЭЛ-1 и фотометра ФЭУ-1А в проходящем свете с запирающем светофильтром с максимумом светопропускания на длине волны 570 нм при напряжении 900 В. Диплоидным эталоном служили лимфоциты периферической крови и малые лимфоциты лимфатических узлов.

В контрольной группе гистологическое исследование установило, что уже с первых суток в печени возникала жировая дистрофия гепатоцитов. В дальнейшем она нарастала и через месяц большинство гепатоцитов имели признаки жировой крупнокапельной дистрофии, при которой большая часть клетки была заполнена жировой каплей, а также появлялись некротизированные, погибшие гепатоциты. Через 20-25 дней от начала введения четыреххлористого углерода вокруг погибших гепатоцитов возникала инфильтрация из лимфоидных клеток. На 60-е сутки в ткани печени на месте погибших гепатоцитов начинали выявляться нежные коллагеновые волокна, окрашивающиеся по ван Гизону в розовый цвет. Через 90 дней в органе обнаруживалось разрастание соединительной ткани, которое к 150-180 дню приводило к формированию цирроза портального типа с формированием ложных долек и наличием вокруг них соединительнотканных септ.

В опытной группе жировая дистрофия гепатоцитов начинала определяться только к концу первого месяц. Некротизированные гепатоциты, имевшие место в гистологических препаратах, носили единичный характер. Разрастание соединительной ткани начинало определяться на 90-е сутки от начала эксперимента. Через 180 суток в гистологических препаратах определялась картина умеренного разрастания соединительной ткани без образования ложных долек.

Исследование ферментативной активности гепатоцитов выявило, что в опытной группе имело место более высокая активность окислительно-восстановительных ферментов по сравнению с контрольной группой.

У животных обоих групп имели место регенераторные проявления со стороны гепатоцитов, проявляющиеся пролиферацией гепатоцитов. В опытной группе отмечалась выраженная полиплоидизация гепатоцитов, повышение числа митотически делящихся клеток и резкое увеличение числа двуядерных гепатоцитов.

Таблица 4
Число митозов у животных опытной и контрольной групп.
Время введения препарата (сутки)	Опыт М±м	Контроль М±м
30	1,2±0,3	0,5±0,1
60	2,4±0,7	0,3±0,05
90	2,6±0,4	0,6±0,05
120	2,0±0,7	0,4±0,1
150	1,8±0,3
180	1,8±0,6	–

Таблица 6
Плоидность ядер гепатоцитов у животных опытной и контрольной групп.
Время введения препарата (сутки)	Опыт М±м	Контроль М±м
	Диплоидные/тетраплоидные	Диплоидные/тетраплоидные
30	32/68	35/65
60	26/74	33/67
90	33/67	36/64
120	36/64	47/53
150	44/56	37/53
180	39/61	45/55

Из таблиц 4-6 следует, что введение биологически активных препаратов активизирует пролиферативную активность гепатоцитов и, следовательно, способствует восстановлению ткани печени на фоне повреждающего действия четыреххлористого углерода.

Таким образом, гистологическая картина и морфометрическое исследование свидетельствуют о том, что введение трепела и микроэлементного препарата на основе терпенойдов – «Сувар» стимулирует пролиферативную активность гепатоцитов и, следовательно, способствует восстановлению структуры печени после.

Формула изобретения

Способ восстановления паренхимы поврежденной печени крыс, включающий введение биологически активного препарата, отличающийся тем, что в качестве биологически активного препарата используют микроэлементный препарат «Сувар» в количестве 45-50 мг/кг массы и трепел в количестве 1,25-1,3 мг/кг массы, введение осуществляют один раз в сутки с основным кормом.