Патент на изобретение №2396244

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРПУРОГАЛЛИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к фармакологическому производству и может быть использовано для получения пурпурогаллина. Способ предусматривает ферментативное окисление пирогаллола в присутствии перекиси водорода и последующую хроматографическую очистку целевого продукта. В качестве источника фермента и перекиси водорода используют морских ежей Scaphechinus mirabilis, находящихся в биореакторе с морской водой. В биореактор добавляют водный раствор пирагаллола до его концентрации в морской воде 0,4-0,6 мг/мл. Хроматографическую очистку осуществляют на полихроме-1 с последующим элюированием целевого продукта с сорбента 40-60% водным раствором этилового спирта, упариванием в вакууме и кристаллизацией из водного раствора спирта. Изобретение позволяет увеличить выход пурпурогаллина. 3 ил.

Изобретение относится к фармакологическому производству и может быть использовано для получения биологически активных веществ из гидробионтов.

Плоский морской еж Scaphechinus mirabilis является источником получения эхинохрома А – субстанции кардиологического и офтальмологического препаратов «Гистохром», биологически активных добавок «Тимарин», «Золотой Рог» и других. В то же время это ценное природное сырье может служить источником и продуцентом других биологически активных веществ, в частности пурпурогаллина.

Природный антиоксидант – пурпурогаллин представляет собой индивидуальное соединение 2,7,8,9-тетрагидроксибензо[f]трополон.

Химическая формула пурпурогаллина:

Молекулярный вес 220,18.

Селективность пурпурогаллина как антиоксиданта обусловлена тем, что он является ловушкой для супероксид анионов пероксида водорода или гидроксил радикалов. Эффективность пурпурогаллина и его гликозидов намного выше, чем эффективность антиоксидантов Тролокс и аскорбиновой кислоты. Он нормализует состав крови больных с ишемической болезнью сердца. Пурпурогаллин не токсичен и устойчив в кровотоке в нативном состоянии в течение нескольких недель. На его основе могут быть созданы лекарственные препараты для лечения заболеваний, вызванных оксидативным стрессом.

Недостатками данного способа являются:

– использование в качестве катализатора драгоценного металла (порошкового серебра), что значительно удорожает процесс;

– ограниченность сырьевой базы и, как следствие, непригодность способа для промышленного использования.

Известен способ получения производных пурпурогаллина в биохимическом реакторе с использованием биологически чистой культуры микроорганизмов рода Absidia capable [US 5650439, 22.07.1997]. Сущность способа состоит в инакуляции исходной культуры в питательную среду при pH 7 в течение 9 дней. Полученный бульон экстрагируют бутанолом при pH 2. Бутанольный экстракт концентрируют и последовательно хроматографируют на Dianon НР-21 в системе вода-ацетон, сефадексе LH-20 в метаноле, Bond elute C₁₈ в системе вода-метанол. Концентрат экстрагируют этилацетатом при pH 2 и очищают на Capcellpae C₁₈ в системе метанол-вода-NaH₂PO₄ при pH 2,2. Из 10 л бульона получается 14 мг коричневого аморфного порошка 8-O-пурпурогаллинкарбоксикислоты.

Недостатками данного способа являются:

– получение в качестве конечного продукта производного пирогаллола в виде кислоты;

– длительность процесса очистки (4-х стадийная препаративная колоночная хроматография);

– длительность процесса получения исходного экстракта (9 суток);

– использование токсичных реактивов (метанол, н-бутанол);

необходимость соблюдения стерильности процесса (микробиологическое производство).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения пурпурогаллина путем ферментативного окислительного синтеза из пирогаллола и катехола. Способ включает растворение 1,0 г пирогаллола и 1,0 г катехола в смеси ацетон – фосфатно-цитратный буфер рН 5,0 (1:10 по объему, 50 мл) с добавлением 2 мг пероксидазы хрена и последовательным добавлением четырехкратно в течение часа при перемешивании 2 мл 3,13% перекиси водорода. Пирогаллол экстрагируют из реакционной смеси этилацетатом (3 раза по 50 мл), концентрируют и хроматографируют на Сефадексе LH-20 с последующим элюированием водно-ацетоновой смесью (40%). После упаривания элюата получают 300 мг пурпурогаллина. Выход целевого продукта – 12% [US 2005/0049284 А1, 2005.02.03].

Недостатками известного способа являются:

– низкий выход целевого продукта (12%);

– использование пожароопасных реактивов (этилацетат, ацетон).

Задачей изобретения является разработка способа получения пурпурогаллина из гидробионтов.

Поставленная задача решена способом получения пурпурогаллина путем ферментативного окисления пирогаллола в присутствии перекиси водорода с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, в котором согласно изобретению в качестве источника фермента и перекиси водорода используют морских ежей Scaphechinus mirabilis, находящихся в биореакторе с морской водой при температуре 18-22°С, в который добавляют водный раствор пирагаллола до конечной его концентрации в морской воде 0,4-0,5 мг/мл, хроматографическую очистку осуществляют на полихроме-1 с последующим элюированием целевого продукта с сорбента 40-60% водным раствором этилового спирта, упариванием в вакууме и кристаллизацией из водного раствора этилового спирта. Выход пурпурогаллина составляет 75% от веса исходного сырья.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в увеличении выхода пурпурогаллина в 6 раз по сравнению с его выходом по способу-прототипу. Способ позволяет рационально использовать ценное биологическое сырье – морских ежей, которые являются сырьем для производства эхинохрома А – субстанции лекарственных препаратов серии «Гистохром».

Предлагаемый способ получения пурпурогаллина существенно отличается от аналогов и прототипа, т.к. основан на применении варианта биореактора с живыми макроорганизмами (морские ежи), в котором происходит биосинтез пурпурогаллина из пирогаллола с использованием ферментных систем морских ежей S. Mirabilis и пероксида водорода.

Биореактор представляет собой проточный аквариум, в который помещают морских ежей. В морскую воду вводят искусственно пирогаллол, и морские ежи начинают превращать его в пурпурогаллин.

Образование пурпурогаллина происходит по схеме

Источником пероксида водорода служат симбиотные с морскими ежами микроорганизмы и диатомовые водоросли, являющиеся основным объектом питания ежей S. mirabilis. Эти микроводоросли синтезируют Н₂О₂ за счет собственного фотосинтезирующего аппарата. Помимо этого, в состав оболочных панцирей и игл морских ежей входят полигидроксинафтохиноны, в частности эхинохром А. Полигидроксинафтохиноны находятся внутри клеток морских ежей, покрывающих или входящих в состав биоминерального матрикса ежей. В комплексе с клеточными ферментами (флавиновыми белками) они участвуют в процессе образования пероксида водорода, который при наличии в организме ежей фермента каталазы и других пероксидаз, превращается в кислород и воду, обеспечивая кислородное питание всех внутренних органов и тканей морских ежей.

На фиг.1 представлена принципиальная схема биореактора.

Морских ежей помещают на дно аквариума (1) и заливают морской водой (слой воды должен быть выше поверхности ежей на 2 см). Из емкости (2) дозировано прибавляют раствор пирогаллола до конечной концентрации его в морской воде 0,4-0,6 мг/мл. Включают насос, циркулирующий воду через фильтр-ловушку (3) с полихромом-1. Биореактор функционирует в течение 24 часов. При заполнении фильтра-ловушки пурпурогаллином на две трети фильтр-ловушку выводят из системы и заменяют новым. Степень заполнения определяют визуально: пурпурогаллин имеет темно-коричневый цвет. Фильтр-ловушку промывают дистиллированной или деминерализованной водой, затем 10% водным раствором этилового спирта. Целевой продукт элюируют с сорбента 40-60% водным раствором этилового спирта. Раствор пурпурогаллина упаривают в вакууме, а затем кристаллизуют целевой продукт из водного раствора этилового спирта.

После окончания цикла работы морских ежей промывают морской водой, дистиллированной или деминерализованной водой и далее используют для получения эхинохрома А по фармакопейной технологии.

На фиг.2 представлен состав полифенолов в биореакторе через 6 часов инкубации морских ежей в присутствии пирогаллола (анализ методом ВЖХ).

На фиг.3 представлен состав полифенолов в элюате с фильтра-ловушки (анализ методом ВЖХ).

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения: ПРИМЕР.

Морских ежей вида S. mirabilis в количестве 0,5 кг помещают в биореактор (1) и заливают морской водой (0,5 л) при 20°С. Слой воды должен быть выше поверхности ежей на 2-3 см («зеркало»). Из емкости (2) по каплям прибавляют 50 мл раствора пирогаллола в морской воде в концентрации 5 мг/мл до конечной его концентрации в морской воде 0,5 мг/мл. Включают насос, циркулирующий воду через фильтр-ловушку (3), заполненный 0,1 кг полихрома-1. Процесс прекращают после заполнения двух третей фильтра-ловушки. Фильтр промывают дистиллированной водой (0,5 л), затем 10% водным раствором этилового спирта (0,1 л). Пурпурогаллин элюируют с сорбента 0,5 л 40% водного раствора этилового спирта и 0,5 л 60% водного раствора этилового спирта. Раствор упаривают в вакууме и кристаллизуют из 40% водного раствора этилового спирта. Ежей промывают морской, затем дистиллированной водой и выгружают из реактора.

Выход пурпурогаллина составляет 750 мг за 1 цикл работы биореактора (24 часа), т.е. 75% от веса исходного сырья.

Формула изобретения

Способ получения пурпурогаллина путем ферментативного окисления пирогаллола в присутствии перекиси водорода с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве источника фермента и перекиси водорода используют морских ежей Scaphechinus mirabilis, находящихся в биореакторе с морской водой, в который при температуре 18-22°С добавляют водный раствор пирогаллола до конечной его концентрации в морской воде 0,4-0,6 мг/мл, хроматографическую очистку осуществляют на полихроме-1 с последующим элюированием целевого продукта с сорбента 40-60%-ным водным раствором этилового спирта, упариванием в вакууме и кристаллизацией из водного раствора этилового спирта.

РИСУНКИ