Патент на изобретение №2395081
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2-МЕТОКСИ-4-АЛЛИЛГИДРОКСИБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биологии и токсикологической химии. В способе определения биологический объект двукратно по 30 минут настаивают с этилацетатом, этилацетатные извлечения отделяют, объединяют, обезвоживают, упаривают объединенное извлечение вначале в токе воздуха до незначительного объема, затем в токе азота до полного испарения растворителя, остаток растворяют в системе растворителей, хроматографируют в макроколонке с сорбентом с использованием многокомпонентной подвижной фазы, фракции элюата, содержащие 2-метокси-4-аллилгидроксибензол, объединяют, упаривают. Перед хроматографированием остаток растворяют в гексане, экстрагируют, отделяют, подкисляют, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают, доводят до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Определение проводят методом хромато-масс-спектрометрии с применением капиллярной макроколонки. Регистрируют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика. Способ обеспечивает повышение чувствительности определения. 3 табл.
Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых. Известен способ определения гидроксибензола и ряда его производных в биологическом материале путем измельчения биологической ткани, смешивания ее с водой, подкисления органической кислотой и осуществления дистилляции с водяным паром с последующим сбором дистиллята, экстракцией анализируемых веществ из дистиллята диэтиловым эфиром, отгонкой экстрагента и определением исследуемых соединений методом броматометрического титрования (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. – М.: Медицина, 1975. – С.67-69, 111-114). Способ малоселективен, отличается недостаточно высокой чувствительностью. Известен способ определения алкилзамещенных гидроксибензола (4-метилгидроксибензола) в моче, заключающийся в том, что анализируемую пробу подкисляют серной кислотой, перегоняют с водяным паром, полученный дистиллят обрабатывают 65% азотной кислотой, выдерживают при 37°С в течение 24 часов, нейтрализуют 20% раствором гидроксида натрия, прибавляют к реакционной смеси буферный раствор с рН 12 и проводят полярографическое определение (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных ядов в организме. – Л.: Медицина, 1970. – С.204). Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокой чувствительностью, не может обеспечить селективное определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в присутствии близких по структуре гидроксипроизводных бензола.
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью. Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности определения. Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, обезвоживают, этилацетат испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают токе воздуха до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), хроматографируют в макроколонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 м.м с неподвижной фазой HP – 5/MS, содержащей полиэтиленгликоль и силоксан в массовом отношении 95:5, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, с регистрацией масс-спектра по полному ионному току, количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола вычисляют из данных хроматограммы, полученной регистрацией интенсивности сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70·эВ. Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 2-метокси-4-аллилгидроксибензрл, дважды (каждый раз в течение 30 минут) настаивают с этилацетатом при перемешивании, отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, этилацетат испаряют при 18-22°С в токе воздуха до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирные извлечения отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до незначительного объема, а затем – в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (4.0:5:1), хроматографируют в макроколонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой HP – 5/MS, содержащей полиэтиленгликоль и силоксан в массовом отношении 95:5, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, с регистрацией масс-спектра по полному ионному току, количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола вычисляют из данных хроматограммы, полученной регистрацией интенсивности сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови К 10 г крови человека прибавляют 10 мг 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр с безводным сульфатом натрия, сульфат натрия промывают 20 мл этилацетата, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 7 включительно объединяют, упаривают при 18-22°С вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем – в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 25 мл гексана (раствор А). 2,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки гексаном (раствор Б). 2 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр. Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies модели 6850 с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 этой же фирмы. Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм. Неподвижная фаза – HP-5/MS, содержащая полиэтиленгликоль с силоксаном (95% и 5%). Начальная температура термостата колонки составляет 50°С (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°С до 150°С со скоростью 50°С в минуту, от 150°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту с выдержкой при конечной температуре 8 минут. Температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса – 260°С, температура квадруполя – 150°С, температура источника ионов – 230°С. В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута, режим с делением потока 1/20. Масс-селективный детектор. работает в режиме электронного удара (70·эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Пик на хроматограмме с временем удерживания 3,33 мин соответствует 2-метокси-4-аллилгидроксибензолу. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 65, 77, 91, 103, 121, 131, 137, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 164, интенсивность которой принимается за 100%. 2-метокси-4-аллилгидроксибензол идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре. По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал. Построение градуировочного графика В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,1, 0,25, 0,5, 1,5 и 2,5 мл 0,025% раствора 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в гексане и доводят объем содержимого каждой колбы до метки гексаном. 2 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр. Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies модели 6850 с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 этой же фирмы. Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм. Неподвижная фаза – HP-5/MS, содержащая полиэтиленгликоль с силоксаном (95% и 5%). Начальная температура термостата колонки составляет 50°С (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°С до 150°С со скоростью 50°С в минуту, от 150°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту с выдержкой при конечной температуре 8 минут. Температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса – 260°С, температура квадруполя – 150°С, температура источника ионов – 230°С. В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута, режим с делением потока 1/20. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500. По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1·10-9-1·10-7 г. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид: S=815246·C+52130, где S – площадь хроматографического пика; С – концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг. Результаты количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови представлены в таблице 1. Пример 2 Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 10 мг 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр с безводным сульфатом натрия, сульфат натрия промывают 20 мл этилацетата, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до объема 0,5-1,0 мл, а затем – в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ым раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до объема 0,5-1,0 мл, а затем – в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 7 включительно объединяют, упаривают при 18-22°С вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, затем – в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 25 мл гексана (раствор А). 2,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки гексаном (раствор Б). 2 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр. Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies модели 6850 с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 этой же фирмы. Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм. Неподвижная фаза – HP-5/MS, содержащая полиэтиленгликоль с силоксаном (95% и 5%). Начальная температура термостата колонки составляет 50°С (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°С до 150°С со скоростью 50°С в минуту, от 150°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту с выдержкой при конечной температуре 8 минут. Температура инжектора составляет 280°С, температура, интерфейса – 260°С, температура квадруполя – 150°С, температура источника ионов – 230°С. В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута, режим с делением потока 1/20. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500. Пик на хроматограмме с временем удерживания 3,33 мин соответствует 2-метокси-4-аллилгидроксибензолу. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 65, 77, 91, 103, 121, 131, 137, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 164, интенсивность которой принимается за 100%. 2-метокси-4-аллилгидроксибензол идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре. По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал. Построение градуировочного графика Процесс построения градуировочного графика и его уравнение приведены выше в примере 1. Результаты количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени представлены в таблице 2. Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 40 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 12 раз – в биологическом материале. Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.
Формула изобретения
Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 мин настаивают с этилацетатом, этилацетатные извлечения отделяют, объединяют, обезвоживают, упаривают объединенное извлечение вначале в токе воздуха до незначительного объема, затем в токе азота до полного испарения растворителя, остаток растворяют в системе растворителей, хроматографируют в макроколонке с сорбентом с использованием многокомпонентной подвижной фазы, фракции элюата, содержащие 2-метокси-4-аллилгидроксибензол, объединяют, упаривают вначале в токе воздуха до незначительного объема, затем в токе азота до полного испарения растворителя, остаток растворяют в гексане с последующим определением физико-химическим методом, отличающийся тем, что перед хроматографированием в макроколонке с сорбентом остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан – диоксан – пропанол-2 (40:5:1), при хроматографировании в макроколонке используют силикагель L 40/100 мкм, в качестве подвижной фазы – смесь растворителей гексан – диоксан – пропанол-2 (40:5:1), физико-химическим методом определения является хромато-масс-спектрометрия, определение методом хромато-масс-спектрометрии ведут с применением капиллярной колонки длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой HP-5/MS, содержащей полиэтиленгликоль и силокеан в массовом соотношении 95:5, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика.
|
||||||||||||||||||||||||||
1, с.7-9. RU 2269137 C1, 27.01.2006. RU 2319142 C1, 10.03.2008. RU 2200958 C1, 20.03.2003. RU 2188416 C1, 27.08.2002. US 3544271 A1, 01.12.1970. ЕЛИЗАРОВА М.К. и др. Особенности определения 2- и 4-метилгидроксибензола в биологическом материале.Состояние, перспективы судебно-токсилогической службы и научных исследований. – Харьков: 2005, с.50-51. ШВАЙКОВА М.Д. Токсикологическая химия. – М.: Медицина, 1975, с.67-69, 111-114. ГАДАСКИНА И.Д. и др. Превращения и определение промышленных ядов в организме. – Л.: Медицина, 1970, с.204.
