Патент на изобретение №2393479
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСОБЕННОСТЕЙ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины. Для оценки особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита выделяют ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом. В случае выявления генотипа 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания. В случае выявления аллеля 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания хронического гломерулонефрита с умеренной протеинурией. Способ позволяет в кратчайшие сроки осуществить прогнозирование течения хронического гломерулонефрита и определить стратегию терапии данного заболевания. 3 табл.
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека. В настоящее время хронический гломерулонефрит (ХГН) представляет серьезную проблему современной медицины в связи с тяжестью болезни и широкой распространенностью в разных регионах мира [1]. В нашей стране ежегодно с диагнозом хронический гломерулонефрит госпитализируется около 1-2% от всех терапевтических больных. В структуре всей почечной патологии, составляющей около 200 случаев на 100 тыс. населения, ХГН является наиболее частым заболеванием, доля которого достигает 40% [2]. Следует отметить, что заболевание поражает преимущественно лица трудоспособного возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб [3]. ХГН нередко приводит к летальности в связи с достижением терминальной стадии хронической почечной недостаточности [4, 5]. Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют интерлейкины и факторы роста [6]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном интегральные мембранные белки [7], ряд интерлейкинов [6], факторы некроза опухоли [8]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов интерлейкинов в отношении ХГН до сих пор не проведены. Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов интерлейкинов – это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса. Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки клинического течения хронического гломерулонефрита. Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки патогенетической значимости полиморфизмов генов интерлейкинов в течение хронического гломерулонефрита. Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания. В соответствии с поставленной задачей был разработан способ особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов и в случае: – выявления генотипа – 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания; – в случае выявления аллеля – 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией. Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию аллелей и генотипов генов интерлейкинов. Способ осуществляют следующим образом. ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом методом фенол-хлороформной экстракции. Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфных локусов интерлейкина 13-4257G/A IL-13 выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов интерлейкинов, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл. амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Для анализа полиморфизма гена интерлейкина 13-4257G/A IL-13 используют эндонуклеазу рестрикции BspLI (“СибЭнзим”). Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Фрагменты длиной 156 п.н. соответствовали аллелю – 4257А гена IL-13, 138 и 18 п.н. – аллелю – 4257G, фрагменты длиной 156, 138 и 18 п.н. наблюдались у гетерозигот – 4257AG. Мутантный аллель – 4257А обусловливает повышение продукции интерлейкина 13 и IgE и, соответственно, обладает противовоспалительным и атопическим эффектами. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий Возможность использования предложенного способа для определения клинического прогноза и стратегии терапии данного заболевания подтверждает анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом и 241 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Контрольную группу составили индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Белгородской области и не имеющие родства между собой. Впервые выявлено, что генотип – 4257АА гена IL-13 является маркером: – тяжелой артериальной гипертензии, частота встречаемости которого у больных с уровнем артериального давления >160/110 более чем в 3 раза превысила долю этого генотипа в контрольной группе (20,69% и 6,54% соответственно; – высокого уровня среднесуточной протеинурии (4,70 г/сут. против 2,03 г/сут. и 2,37 г/сут. у пациентов с генотипами – 4257GG и – 4257AG соответственно; р=0,05), что подтверждает анализ ассоциации генотипов полиморфных генетических маркеров интерлейкинов со среднесуточной протеинурией у больных ХГН, проведенный с использованием дисперсионного анализа (табл.2). Коэффициент детерминации, показывающий какая доля изменчивости протеинурии обусловлена генотипами гена интерлейкина 13, составил 5,08% (табл.2). Полученные данные согласуются с результатами анализа распределения генов и генотипов изучаемых полиморфных генетических систем в группах больных ХГН с разным уровнем протеинурии (незначительная протеинурия – до 1 г/сут, умеренная – 1-3 г/сут, выраженная – более 3 г/сут).
Также впервые выявлено, что аллель – 4257А гена IL-13 является маркером умеренного уровня протеинурии. Пациенты с умеренной протеинурией характеризуются наибольшей частотой аллеля – 4257А гена IL-13 по сравнению с больными с незначительной протеинурией и выраженной протеинурией (42,86% против 22,73% и 26,76% соответственно;
Таким образом, наличие у больных ХГН генотипа – 4257АА гена IL-13 обусловливает формирование тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания. Аллель – 4257А гена IL-13 ассоциирован с умеренной протеинурией. Литература.
Формула изобретения
Способ оценки особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов, отличающийся тем, что в случае выявления генотипа – 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания, а в случае выявления аллеля – 4257А гена IL-13 делают вывод вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5, 2006, с.7-10. ШЕСТАКОВ А.Е. Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук, 2006, 24 с. KITCHING A. R. et al. Endogenous IL-13 Limits Humoral Responses and Injury in Experimental Glomerulonephritis but Does Not Regulate Thl Cell-Mediated Crescentic Glomerulonephritis, J. Am Soc Nephrol. 2004, Sep; 15(9):2373-82, (реферат), [он-лайн], [найдено 10.11.2009], найдено из базы данных PubMed.
2, наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия