Патент на изобретение №2393478

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИЖИЗНЕННЫХ ПАРАНЕКРОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ И КОСТНОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Для определения прижизненных паранекротических изменений тканей органов и костной системы экспериментальных животных определяют молекулы средней массы в плазме крови методом спектрофотометрии в диапазоне 250-300 нМ длин волн. Полученные результаты оценивают по величине площади фигуры, образованной кривой величины поглощения и осью нулевой отметки. При увеличении молекул средней массы относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определяют прижизненные паранекротические изменения. Способ позволяет выявить паранекротические изменения в тканях органов и костной системе экспериментальных животных без их умерщвления. 1 табл.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может использоваться при моделировании патологических реакций, процессов и состояний человека для определения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных.

Паранекротическими названы те изменения в тканях органов, которые могут в зависимости от условий перейти в необратимую стадию некроза либо восстановиться в исходное состояние (1). Известно, что паранекротические процессы возрастают в структурах нервной ткани и в других органах при различных воздействиях на организм экспериментальных животных (2), а также при нарушениях эндокринной регуляции (3), которые сопровождаются повышением сорбции витальных красителей.

До сих пор в экспериментальной медицине структурно-функциональные изменения в тканях органов выявляются после умерщвления животных, исследования биоптатов предполагаемых поврежденных органов (4). Существуют также химический способ выявления прижизненного изменения в тканях органов путем исследования химического состава крови (5) и гистохимический способ оценки прижизненных паранекротических изменений в тканях органов (6). Однако эти способы имеют ряд недостатков, связанных с необходимостью обязательного умерщвления животных и травматизации изучаемых органов.

В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ гистохимического определения паранекротических прижизненных изменений в тканях органов, заключающийся в том, что по количеству адсорбированной тканью органов краски нейтральрот судят о наличии паранекротических прижизненных изменений (7), так как эта краска окрашивает денатурационные изменения в клетке в обратимой стадии (8).

Способ осуществляется следующим образом. Подопытному животному (в данном случае крысе) внутрибрюшинно вводят 0.5% водный раствор нейтральрота в количестве 0.25 мл на 100 г массы. Затем спустя 30 мин животное забивают и извлекают органы, которые помещают в элюируемую среду (подкисленный концентрированной серной кислотой раствор 70° этилового спирта) в объеме 5 мл на 1 орган. Через 24 часа элюат фотометрируют для определения адсорбированной краски тканью органов. Для оценки тканевого распределения краски органы помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°. Результат оценивают в мг на грамм сухой ткани.

Данный способ определения паранекротических прижизненных изменений обладает недостатком, связанным с необходимостью обязательного умерщвления животных для последующей экстракции краски из тканей органов, и, таким образом, отсутствует возможность изучения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных в динамике.

Техническим результатом изобретения является возможность изучения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментального животного в динамике, а также определение прижизненных паранекротических изменений в тканях органов животного без его умерщвления.

Технический результат достигается тем, что у экспериментальных животных определяют молекулы средней массы (МсМ) в диапазоне 250-300 нМ в плазме крови и при их увеличении относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определяют прижизненные изменения в тканях органов и костной системе.

Способ осуществляется следующим образом:

В плазме крови (0.5 мл) экспериментального животного по методу М.Я.Малаховой (8) определяют МсМ. Забор крови в объеме 1 мл осуществляют при декапитации или из хвостовой вены (у крыс). Осаждение крупномолекулярных белков проводят 15% раствором трихлоруксусной кислоты (к 0.5 плазмы крови добавляют 0.5 мл 15% р-ра трихлоруксусной кислоты). Сгусток денатурированных белков размешивают стеклянной палочкой, после чего центрифугируют при 5000 оборотах в минуту. Затем к 0.5 мл центрифугата добавляют 9.5 мл дистиллированной воды и фотометрируют на спектрометре при длинах волн от 250 до 300 нМ. Полученные результаты оценивают по величине площади фигуры, образованной кривой величины поглощения и осью нулевой отметки. Выражают эту величину в условных единицах. Затем – постановка эксперимента, заключающегося в моделировании патологических реакций, процессов и состояний. В данном случае использовали модель травматического воздействия на организм животного путем механического перелома трубчатых костей голени. Спустя 24 часа после нанесения травмы исследуют кровь на содержание МсМ и при их увеличении относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определяют прижизненные изменения в тканях органов и костной системе экспериментального животного.

Отличительным существенным признаком заявляемого способа является определение у экспериментальных животных молекул средней массы (МсМ) в плазме крови и при их увеличении относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определение прижизненных изменений в тканях органов и костной системе.

Причинно-следственная связь между отличительным существенным признаком заявляемого способа и достигаемым результатом:

Как известно, воздействие многих патогенных факторов может привести к существенным сдвигам нейроэндокринной регуляции с последующим нарушением внутренней среды и появлениям ряда гуморальных факторов эндогенизации патологических процессов (9). При этом вовлекаются в патологический процесс и не поврежденные органы (в данном случае не травмированные органы), усугубляя течение основного патологического процесса. В настоящее время среди факторов эндогенной интоксикации важнейшее значение придается МсМ (10), которые представлены классами соединений с молекулярной массой до 5000Д. Диапазон 250-270 нМ длин волн, предлагаемый в данном способе для определения прижизненных изменений в тканях органов и костной системе экспериментального животного, подобран авторами заявки экспериментальным путем.

Нами впервые установлена коррелятивная взаимосвязь между увеличением относительно исходного уровня МсМ, определяемого в спектре длин волн от 250 до 270 нм, и прижизненными паранекротическими изменениями в тканях внутренних органов и костной системе экспериментального животного.

Отличительный существенный признак заявляемого способа является новым и позволяет определять прижизненные паранекротические изменения в тканях органов животного без его умерщвления, что дает возможность изучать прижизненные паранекротические изменения в тканях органов и костной системе экспериментального животного в динамике.

Пример конкретного выполнения:

(Крысы 3а и 4а из протокола 7). Постановка эксперимента: перелом костей правой голени под общей анестезией. Исследование спустя 18 дней по способу-прототипу и предлагаемому способу.

У крысы 3а из хвостовой вены была взята кровь и исследована по заявляемому способу на определение в плазме крови МсМ в диапазоне 250-300 нМ, при этом использовали спектрофотометр. При этом было установлено, что в диапазоне 250-270 нМ МсМ составило 33,7 у.е., в то время как у контрольной крысы этот показатель равнялся 10,8 у.е., что свидетельствует о прижизненных паранекротических изменениях в тканях органов и костной системе крысы 3а.

У крысы 4а из хвостовой вены также была взята кровь и исследована по заявляемому способу на определение в плазме крови МсМ в диапазоне 250-300 нМ. При этом было установлено, что в диапазоне 250-270 нМ МсМ составило 8,9 у.е., у контрольной крысы этот показатель равнялся 10,8 у.е., что свидетельствует об отсутствии прижизненных паранекротических изменениях в тканях органов и костной системе крысы 4а.

Полученные данные подтверждаются результатами, полученными при исследовании прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе крысы по способу-прототипу:

Сущность способа поясняется результатами исследования, полученными на крысах с переломом трубчатых костей (таблица – Сравнительная таблица оценки прижизненных паранекротических изменений тканей органов и костной системы крыс с экспериментальным переломом костей голени по способу-прототипу и по заявляемому способу).

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что прижизненные паранекротические изменения в тканях органов крыс, определяемые по способу-прототипу, выявляются при использовании заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ может быть использован для выявления прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных без их умерщвления, что дает возможность изучения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных в динамике.

Таблица 1
Сравнительная таблица оценки прижизненных паранекротических изменений тканей органов и костной системы крыс с экспериментальным переломом костей голени по способу-прототипу и по заявляемому способу
Сроки наблюдения	КОНТРОЛЬ (п=9)	Через 24 часа (п=8)	Через 18-21 день (п=7)
Ткани органов:
Головной мозг	0.0043+0.0002	0.0081+0.0006*	0.0039+0.0006
Спинной мозг	0.0039+0.0006	0.0061+0.0004*	0.0047+0.0008
Печень	0.0016+0.0001	0.0072+0.0008*	0.0013+0.0001
Сердце	0.0075+0.0008	0.0210+0.0010*	0.0082+0.0004
Почки	0.0130+0.0020	0.0520+0.0110*	0.0160+0.0020
Бедренная кость	0.0017+0.0001	0.0	0.0019+0.0003
Кости голени	0.0021+0.0002	035+0.0001*	0.0022+0.0005
(способ-прототип)		0.0036+0.0002*
Молекулы средней	11.3+2.7 у.е.	25.2+3.4 у.е.*	9.8+3.7 у.е.
массы (у.е. – условные единицы)	(250-270 нМ)	(250-270 нМ)	(250-270 нМ)
31.5+3.1 у.е	17.8+5.4 у.е.	29.6+3.2 у.е.
(заявляемый способ)	(280-300 нМ)	(280-300 нМ)	(280-300 нМ)
Примечание: * – достоверные изменения (р<0.05)

Источники информации

1. – С.5-60.

2. Романов С.Н. Биологическое действие механических колебаний. – Л., 1983. – 208 с.

3. Хегай М.Д. Патофизиологические основы развития осложнений при инсулинозависимом сахарном диабете. – Автореф. дисс. на соискание уч. степени докт. мед. наук. – СПб., 1998. – 39 с.

4. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. – М., 2000. Т.1. С.11-23.

5. Хомуло П.С. Неврогенный атеросклероз и липидоз аорты. – М., 1972. С.237-247.

6. Граменицкий Е.М. Прижизненная окраска клеток и тканей. – Л., 1963. – 149 с.

7. Трошин А.С. Распределение веществ между клеткой и средой. – Л., 1985. – 192 с.

8. Медицинские лабораторные технологии. Справочник / под ред. А.И.Карпищенко, Т.2. – С-Петербург, 2002. 400 с.

9. Крыжановский Г.Н. Введение в общую патофизиологию. – М., 2000. – 71 с.

9. С.7-10.

Формула изобретения

Способ определения прижизненных паранекротических изменений тканей органов и костной системы экспериментальных животных, отличающийся тем, что определяют молекулы средней массы в плазме крови методом спектрофотометрии в диапазоне 250-300 нМ длин волн, при этом полученные результаты оценивают по величине площади фигуры, образованной кривой величины поглощения и осью нулевой отметки, и при увеличении молекул средней массы относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн, определяют прижизненные паранекротические изменения.