Патент на изобретение №2393218
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУРЫ АУТОЛОГИЧНЫХ ЛИМФОЦИТОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к средам для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, и может быть использовано как для лечения, так и для профилактики гнойно-воспалительных осложнений у пациентов. Среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов на основе культуральной среды RPMI – 1640 (Roswell Park Memorial Institute) содержит 10% раствор фитогемоагглютинина и сыворотку собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, объемные %: сыворотка собственной крови пациента – 0,75-1,2; 10%-ный раствор фитогемоагглютинина в культуральной среде RPMI – 1640-0,008-0,013; культуральная среда RPMI – 1640 – остальное до 100%. Изобретение позволяет с высокой степенью надежности исключить аллергические реакции организма пациента, повысить содержание лимфобластов в культуре аутологичных лимфоцитов, исключить появление чужеродного белка и обеспечить необходимую стерильность за счет исключения прорастания бактерий. 1 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, к среде для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, и может быть использовано как для лечения, так и для профилактики гнойно-воспалительных осложнений у пациентов в условиях хирургических, травматологических и других стационаров. Изобретение позволяет быстро и доступно получить безопасный для пациента материал для заместительной клеточной технологии. Известна среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI – 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (см. патент РФ Однако известная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов при своем использовании обладает следующими недостатками: – не обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с необходимым содержанием лимфобластов (содержание лимфомассы до 0,9×109/л), – не обеспечивает надежного исключения аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, – не обеспечивает исключение появления чужеродного белка. Задачей изобретения является создание среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов. Техническим результатом является обеспечение надежного исключения аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключение появления чужеродного белка, обеспечение необходимой и достаточной стерильности за счет исключения прорастания бактерий, а также обеспечение выращивания аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Технический результат достигается в предложенной среде для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов сочетанием компонентов использованных для ее изготовления, а также количественным соотношением входящих в нее компонентов. Технический результат достигается тем, что предложена среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI – 1640 (Roswell Park Memorial Institute), а также 10% раствор фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI – 1640 и сыворотку собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, объемные %:
Культурная среда RPMI – 1640 используется следующего состава:
Среди существенных признаков, характеризующих предложенную среду для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, отличительными являются: – дополнительное содержание в культурной среде 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI – 1640, – дополнительное содержание в культурной среде сыворотки собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, – выбор содержания компонентов, объемные %:
Экспериментальные исследования предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов показали ее высокую эффективность. Предложенная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов при своем использовании в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечивает надежное исключение аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, обеспечивает повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов до 2×109/л, исключает появления чужеродного белка, обеспечивает необходимую и достаточную стерильность. Одновременно было установлено, что использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качественное и количественное содержание предложенной «Среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов» заявленного состава является оптимальным результатом проведения в Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н.Приорова Росмедтехнологий» (ЦИТО) комплекса научно-исследовательских работ. Предложенная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов используется следующим образом. Осуществляют забор цельной крови пациента из любой его центральной или периферической вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл и отстаивают ее в течение 100-140 минут. Затем отбирают лейкоцитарную фракцию в количестве 0,5-1,5 мл и вводят в нее 5 мл культуральной среды RPMI – 1640, а также 5 мл собственной сыворотки пациента. Разливают полученную клеточную взвесь в стерильные емкости по 2 мл и вводят в каждую емкость по 5 мл культуральной среды RPMI – 1640 и по 0,01 мл 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культуральной среде RPMI – 1640. Емкости с культурой лимфоцитов размещают в термостате и выдерживают при температуре 37°С в течение 72 часов, затем полученную в каждой емкости клеточную культуру аутологичных лимфоцитов центрифугируют в физиологическом растворе (5 мл) 3-5 раз при скорости вращения 1000 об/мин по 10 минут, при этом после каждого центрифугирования сливают надосадочную жидкость и в каждую емкость добавляют по 5 мл физиологического раствора для повторения центрифугирования клеточной культуры аутологичных лимфоцитов. Клеточная масса аутологичных лимфоцитов готова для своего использования. Из 5 флаконов, в которых культивировались аутологичные лимфоциты, собирают клеточную взвесь, доводят до объема 10 см3 физраствором и вводят внутривенно пациенту в любую его центральную или периферическую вену. Реализация предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов иллюстрируется следующими клиническими примерами. Пример 1. Пациент П., 55 лет, поступил в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Сочетанная травма. Закрытая черепно-мозговая травма. Сотрясение головного мозга. Закрытый оскольчатый перелом правой бедренной кости со смещением отломков». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 1,0×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,68×109/л. Пациенту выполнили оперативное вмешательство – остеосинтез правой бедренной кости пластиной. Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациента из его центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациента отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI – 1640, содержащей 0,75 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,013 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI – 1640. Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,95×109/л культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов ввели внутривенно пациенту в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период – гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациента составило 1,3×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,8×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,013×109/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациента составило 1,4×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 1,0×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,018×109. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А. У пациента после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациента хорошее. Пример 2. Пациентка К., 65 лет, поступила в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Правосторонний гонартроз 3-4 степени, выраженная вальгусная деформация нижней конечности, анкилоз правого тазобедренного сустава». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 0,95×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,64×109/л. Пациентке выполнили оперативное вмешательство – надмыщелковая остеотомия бедра и надкостный остеосинтез из расширенного латерального доступа. Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациентки из ее центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациентки отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI – 1640, содержащей 1,2 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,010 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI – 1640. Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,92×109/л, культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов, ввели внутривенно пациентке в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период – гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К 3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,25×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,75×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,012×109/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,4×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 1,0×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,017×109. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А. У пациентки после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациентки хорошее. Пример 3. Пациентка Д., 69 лет, поступила в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Левосторонний гонартроз 3-4 степени, выраженная вальгусная деформация нижней конечности, анкилоз левого тазобедренного сустава». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 0,9×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,60×109/л. Пациентке выполнили оперативное вмешательство – надмыщелковая остеотомия бедра и надкостный остеосинтез из расширенного латерального доступа. Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациентки из ее центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациентки отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI – 1640, содержащей 0,95 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,008 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI – 1640. Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,92×109/л культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов, ввели внутривенно пациентке в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период – гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К 3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,25×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,78×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,011×109/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,3×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,9×10%, количество Т-супрессоров составило 0,017×109. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А. У пациентки после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациентки хорошее.
Формула изобретения
Среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), отличающаяся тем, что дополнительно содержит 10%-ный раствор фитогемоагглютинина и сыворотку собственной крови, полученную из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, об.%:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2333243, МПК С12N 5/08, 2005 г.).