Патент на изобретение №2393217

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ARTEMISIA ANNUA L.

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Питательная среда для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. содержит, мг/л: KNO₃ – 1900, NH₄NO₃ – 1650, CaCl₂·6H₂O – 332, MgSO₄·7H₂O – 370, KH₂PO₄ – 170, FeSO₄·7H₂O – 27,85, Na₂ЭДТА – 37,25, Н₃ВО₃ – 6,2, MnSO₄·5H₂O – 24,1, ZnSO₄·7H₂O – 8,6, Na₂MoO₄ – 0,25, KI – 0,83, CuSO₄·5H₂O – 0,025, CoCl₂·6H₂O – 0,025, пиридоксин – 1,0, тиамин хлорид – 1,0, никотинамид – 1,0, 6-БАП – 0,2, НУК – 0,5-1,0, сахароза – 30000, агар – 9000 и воду – до 1 л. Это обеспечивает ускорение роста каллусной ткани, увеличение выхода биомассы и расширение арсенала питательных сред для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения – медицинская промышленность, получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов.

Известна питательная среда для выращивания ткани CILYCCYNILA URALENSIS – продуцента сапонинов (заявка РФ 94026958, А01Н 4/00, публ. 1996.06.10). В известном изобретении для выращивания каллусной ткани CILYCCYNILA URALENSIS используют среду Линсмайера-Скуга с добавлением фитогормонов НУК и 6-БАП.

Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани SILENE VULGARIS (MOENCH) GARCKE (патент РФ 2169769, C12N 5/04, публ. 2001/06/27). В известном изобретении агаризованную среду, содержащую макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу, витамины и гормоны роста, модифицируют гормональным составом 6-БАП и 2,4-Д. Среда дополнительно содержит фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Сапантотенат и никотинамид как источник PP. Установление концентраций используемых солей и витаминов позволяет получить каллусную ткань с периодом субкультивирования 21 сутки и с выходом биомассы 7,14-12,77 г/л. Недостатками известных аналогов является их направленность на культивирование определенных видов растений: cilyccynila uralensis, silene vulgaris, следовательно, оптимизированная среда для выращивания этих видов не подойдет для выращивания Artemisia annua L. Вторым недостатком является использование большого количества различных регуляторов роста, таких как фолиевая кислота, биотин и др. Их использование требует значительного капиталовложения.

Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. (Ashish Baldi, V.K. Dixit Yeild enhancement strategies for Artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua L. Bioresource technology 99 (2008) 4609-4614), выбранная в качестве прототипа. В указанном изобретении для культивирования каллусной и суспензионной культур Artemisia annua L. применяют среду Мурасиге-Скуга, модифицированную добавлением фитогормонов НУК и кинетина и стимуляторов роста: элиситоров (таких, как метилжасмонат), и предшественников артемизинина (таких, как лактон мевалоновой кислоты).

Недостатками известной питательной среды для культивирования клеточной культуры Artemisia annua L. является то, что в качестве одного из гормонов роста используется кинетин, который может влиять на размеры клеток в сторону их уменьшения и отрицательно влиять на накопление вторичных метаболитов, а также то, что для интенсификации роста суспензионной культуры используют дорогие элиситоры и предшественники артемизинина.

Задачей настоящего изобретения является разработка состава питательной среды для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. с целью ускорение роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы. Поставленная задача решается тем, что питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, фитогормоны, витамины, сахарозу, но в отличие от прототипа в качестве гормона дополнительно добавляют бензоаминопурин (6-БАП) при следующем соотношении компонентов, мг/л:

KNO₃ – 1900

NH₄NO₃ – 1650

CaCl₂·6H₂O – 332

MgSO₄·7H₂O – 370

KH₂PO₄ – 170

FeSO₄·7H₂O – 27,85

Nа₂ЭДТА – 37,25

Н₃ВО₃ – 6,2

MnSO₄·5H₂O – 24,1

ZnSO₄·7H₂O – 8,6

Na₂MoO₄ – 0,25

KI – 0,83

CuSO₄·5H₂O – 0,025

CoCl₂·6H₂O – 0,025

Пиридоксин – 1,0

Тиамин хлорид – 1,0

Никотинамид – 1,0

6-БАП – 0,2

НУК – 0,5-1,0

Сахароза – 30000

Агар – 9000

Вода – До 1 л

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин), НУК сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают по 150 мл в колбы на 250 мл, добавляя по 1,35 г агара, с последующей стерилизацией в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Каллусную ткань высаживают в возрасте 15-20 суток, инокулюм – 100-200 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С в условиях непрерывной темноты или на белом свету интенсивностью 2000-4000 лк. Основное количество биомассы накапливается к 15 суткам культивирования, затем ткань переходит к фазе замедленного роста и к 20 суткам ее рост практически прекращается. Ниже приведены примеры конкретного осуществления изобретения.

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ – 1900 мг/л, NH₄NO₃ – 1650 мг/л, MgSO₄·7H₂O – 370 мг/л, КН₂РO₄ – 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ – 6,2 мг/л, MnSO₄·5H₂O – 24,1 мг/л, ZnSO₄·7H₂0 – 8,6 мг/л, Na₂MoO₄·2Н₂O – 0,25 мг/л, KI – 0,83 мг/л, CuSO₄·5H₂O – 0,025 мг/л, CaCl₂·6H₂O – 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄·7H₂O – 27,85 мг/л, Nа₂ЭДТА – 37,25 мг/л), СаСl₂ (СаCl·6Н₂O – 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин – 1,0 мг/л, Тиамин хлорид – 1,0 мг/л, Никотинамид – 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (0,2 мг/л), НУК (0,5 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают по 150 мл в колбы на 250 мл, добавляя по 1,35 г агара, с последующей стерилизацией в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Пробирки стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в асептических условиях в них разливают питательную среду. Каллусную ткань высаживают в возрасте 15-20 суток, инокулюм – 100-200 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С в условиях непрерывной темноты или на белом свету интенсивностью 2000-4000 лк.

Пример 2

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (КNО₃ – 1900 мг/л, NH₄NO₃ – 1650 мг/л, MgSO₄·7H₂O – 370 мг/л, КН₂PO₄ – 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ – 6,2 мг/л, MnSO₄·5H₂O – 24,1 мг/л, ZnSO₄·7H₂O – 8,6 мг/л, Na₂MoO₄·2H₂O – 0,25 мг/л, KI-0,83 мг/л, CuSO₄·5H₂0 – 0,025 мг/л, CoCl₂·6H₂O – 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄·7H₂O – 27,85 мг/л, Na₂ЭДТА – 37,25 мг/л), СаСl₂ (CaCl_2·6Н₂O – 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин – 1,0 мг/л, Тиамин хлорид – 1,0 мг/л, Никотинамид – 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (0,2 мг/л), НУК (1 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают по 150 мл в колбы на 250 мл, добавляя по 1,35 г агара, с последующей стерилизацией в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Пробирки стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в асептических условиях в них разливают питательную среду. Каллусную ткань высаживают в возрасте 15-20 суток, инокулюм – 100-200 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С в условиях непрерывной темноты или на белом свету интенсивностью 2000-4000 лк.

Ростовые характеристики каллусной культуры Artemisia annua L., выращенной на средах с различным содержанием фитогормонов, представлены в Таблице 1.

Таким образом, настоящее изобретения позволяет культивировать каллусную культуру Artemisia annua L. с максимальным выходом биомассы за короткий период времени по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L., характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л: