Патент на изобретение №2393212
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS FOETIDUS 379-К – ПРОДУЦЕНТ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологической промышленности. Получен новый штамм гриба-продуцента пектолитических ферментов Aspergillus foetidus 379-K (ВКПМ F-962). Использование данного штамма Aspergillus foetidus 379-K позволяет получить комплекс пектолитических ферментов с высоким уровнем активности эндополигалактуроназы,
Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологической промышленности, и касается создания нового штамма гриба Aspergillus foetidus – продуцента пектолитических ферментов, применяемых в пищевой промышленности для осветления соков, гидролиза пектинсодержащего сырья, в сельском хозяйстве и других отраслях АПК, где требуется расщепление пектиновых веществ. Штамм получен селекцией с использованием эффективных методов мутагенеза из известного штамма Aspergillus foetidus 37 (ЦMПM-F-270), применяемого для твердофазного культивирования при производстве пектиназ. Изобретение обеспечивает получение нового штамма – продуцента пектолитических ферментов для глубинного культивирования, и получение комплексного ферментного препарата пектолитического действия. Пектолитические ферменты имеют большое промышленное значение в различных отраслях биотехнологии: при получении пектинов; для интенсификации производства соков из плодово-ягодного сырья и осветления вин; для получения пищевых красителей и таннинов; при обработке текстильных волокон (Микробные ферменты и биотехнология. Под ред. В.М.Фогарти. – М.: Агропромиздат, 1986). В связи с этим, селекция новых штаммов – продуцентов пектиназ – актуальна. Известны штаммы – продуценты пектолитических ферментов из рода Aspergillus – Aspergillus awamori 16, Aspergillus foetidus 7 (И.М.Грачева, А.Ю.Кривова, Технология ферментных препаратов. – М.: «Элевар», 2000). Недостатками этих продуцентов являются их низкая продуктивность, недостаточно изученный комплекс ферментов, синтезируемых данными штаммами. Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus foetidus 37, регистрационный номер ЦМПМ-F-270 (Патент СССР Задачей, поставленной настоящим изобретением, является создание штамма гриба Aspergillus foetidus – продуцента пектолитических ферментов с широким комплексом сопутствующих ферментов, для глубинного культивирования. Технический результат, получаемый от создания и использования данного нового селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K, заключается в получении доминирующих пектолитических ферментов с высоким уровнем активности эндополигалактуроназы в составе комплекса и сопуствующих Задача решается созданием нового штамма из известного штамма Aspergillus foetidus 37 с использованием генетических и селекционных методов. В результате многоступенчатой селекции и мутагенеза после 3-кратного УФ-облучения и неоднократного отбора был получен штамм Aspergillus foetidus 379-K – продуцент пектиназ. Проводили сравнительную характеристику уровня активности синтезируемых ферментов заявляемым мутантным штаммом и ранее известным штаммом. Активности ферментов определяли методами, описанными в ГОСТе (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса). Сравнительные показатели уровней активности ферментов в культуральной жидкости штамма Aspergillus foetidus 379-K с прототипом представлены в таблице 1. Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый активный штамм Aspergillus foetidus 379-K, обладающий высоким уровнем синтеза пектиназ, в том числе полигалактуроназы, уровень активности которой, при культивировании глубинным способом, превышает в 6 раз уровень активности известного штамма, что позволяет повысить эффективность технологических процессов получения комплексного ферментного препарата пектолитического действия и применения его в производстве плодово-ягодных соков и морсов. Кроме того, уровень активности Штамм Aspergillus foetidus 379-K депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ генетики 25 июня 2007 года под коллекционным номером ВКПМ F-962. Штамм Aspergillus foetidus 379-K имеет следующие характеристики. Культурально-морфологические признаки. По морфологическим признакам культура представляет сильно ветвящийся мицелий, разделенный перегородками. Конидии, образуемые микромицетом, гладкие. Форма конидий круглая, редко встречается овальной формы. Цвет конидий темно- коричневый, почти черный, но из-за обильного образования воздушного мицелия имеют более серый оттенок. Колонии выпуклые с небольшой возвышенностью в центре. Обратная сторона колонии светло-коричневая. Поверхность колонии слегка складчатая. На среде сусло-агар колонии круглые, к 5 суткам достигают 35-37 мм, имеют мозговидную складчатость. Центральная зона колонии – зона обильного спороношения – диаметром 10-12 мм черного цвета с темно-оливковым оттенком и обильным образованием воздушного мицелия. Край колонии ровный. Обратная сторона колонии светло-коричневого цвета. На среде цитрусового пектина с агаром размер колонии достигает 15-17 мм. Колонии плоские. Центральная зона колонии – зона обильного спороношения – диаметром 3-3,5 мм темно-серого цвета. Физиолого-биохимическая характеристика. Ассимилирует нитратные и аммонийные соли. Культура слабо усваивает глюкозу, мальтозу и сахарозу. Дыхание аэробное. Оптимальная температура роста 28-32°С; оптимальное значение рН для роста и биосинтеза гриба 5,3-5,5. Рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,7 до 3,5. Патогенными свойствами не обладает. Штамм Aspergillus foetidus 379-K использовали для получения пектолитических ферментов. Для ферментативной обработки плодово-ягодного сырья может быть использован концентрированный ферментный препарат, полученный осаждением этанолом из культуральной жидкости грибов Aspergillus foetidus 379-K и Aspergillus foetidus 37 в соотношении 1:3. Сравнительная характеристика концентрированных ферментных препаратов, полученных на основе штаммов Aspergillus foetidus 379-K и известного Aspergillus foetidus 37, приведена в таблице 2. Изобретение характеризуется следующими примерами. Пример 1. Штамм Aspergillus foetidus 379-K культивируют на питательной среде следующего состава, %: неосветленные свекловичные волокна – 3,0; пшеничные отруби – 0,5; (NH4)2SO4 – 0,5; KH2PO4 – 0,1; MgSO4 – 0,1; остальное – водопроводная вода, рН – естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 100 см3 питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 96 часов. Активность пектолитических ферментов в культуральной жидкости гриба Aspergillus foetidus 379-К составляет: ПкС – 2,6 ед/см3; Эндо-ПгС – 1,35 ед/см3; ПэС – 0,96 ед/см3.
Пример 2. Штамм Aspergillus foetidus 379-K культивируют на питательной среде следующего состава, %: неосветленные свекловичные волокна – 3,0; пшеничные отруби – 0,5; (NH4)SO4 – 0,5; КН2РО4 – 0,1; MgSO4 – 0,1; остальное – водопроводная вода, рН – естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 100 см питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 48 часов. Активность пектолитических ферментов составляет: ПкС – 2,02 ед./см3; Эндо – ПгС – 1,85 ед./см3; ПэС – 0,84 ед./см3. Пример 3. Культивирование продуцентов Aspergillus foetidus 379-K и известного Aspergillus foetidus 37 проводили аналогично, как описано в примере 1. Получение концентрированных ферментных препаратов осуществляли методом осаждения этанолом из культуральной жидкости в соотношении 1:3. рН культуральной жидкости 3,2. Сравнительная характеристика приведена в таблице 2.
Формула изобретения
Штамм гриба Aspergillus foetidus ВКПМ F-962 – продуцент пектолитических ферментов.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-глюканаз, ксиланаз, целлюлаз, маннаназ и хитиназ. Штамм получен многоступенчатой селекцией из штамма Aspergillus foetidus 37 (ЦМПМ-Р-270) с использованием мутагенеза. Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии и на скошенном сусло-агаре. 2 табл.
1206303, C12N 9/14, 1986). Недостатком этого штамма является то, что он был создан для культивирования твердофазным методом, и поэтому при глубинном способе он синтезирует низкий уровень активности пектолитических ферментов и других минорных ферментов.