Патент на изобретение №2392865

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИНАМИКИ МЕТАБОЛИЗМА КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию биологических жидкостей. Способ обеспечивает раннее выявление нарушения баланса энергетических реакций у больных с термической травмой. Проводят у больных с термической травмой исследование гемолизата крови. При этом в гемолизате эритроцитов ожоговых больных определяют активность фермента лактатдегидрогеназы (прямой и обратной), вычисляют коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР) по формуле

КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100, где ЛДГпр – активность прямой лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин); ЛДГобр – активность обратной лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин); 100 – поправочный коэффициент, и если значение КБЭР ожоговых больных выше КБЭР здоровых людей, делают вывод о снижении энергетического метаболизма. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию биологических жидкостей.

В качестве прототипа выбран способ оценки динамики метаболизма системы крови, заключающийся в заборе крови и спектрометрическом исследовании в полученных пробах гемолизата амплитуд пиков полос поглощения (см. патент РФ 2315306, G01N 33/49, 2008 г.).

Однако известный способ является узкоспецифичным и не дает возможности ранней оценки нарушения окислительно-энергетических реакций у больного с термической травмой.

Задача предлагаемого изобретения – раннее выявление нарушения баланса энергетических реакций у больных с термической травмой.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови, в гемолизате эритроцитов ожоговых больных определяют активность лактатдегидрогеназы, вычисляют коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР), и если показатель КБЭР у больных с ожогом выше показателя КБЭР здоровых людей, делают вывод о снижении скорости протекания окислительно-энергетических реакций.

Способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой осуществляют следующим образом: в течение первых шести часов после травмы у больного забирают кровь из вены, стабилизируют ее цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1, центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, отделяют плазму от эритроцитов. Эритроцитарную массу промывают в 5 мл физиологического раствора. После осаждения (10 минут при 3000 об/мин) удаляют физиологический раствор с 10-15% поверхностно расположенных эритроцитов. Отмытые эритроциты гемолизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:40. Затем в спектрофотометрическую кювету помещают 2,8 мл 0,05М глицин-щелочного буфера (pH 10), 0,05 мл 0,45 М раствора молочнокислого натрия, 0,1 мл 0,8 мМ окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и добавляют в смесь 0,05 мл гемолизата эритроцитов. Содержимое кюветы (3 мл) быстро перемешивают, измеряют величину его оптической плотности при 340 нм с интервалом 15 сек в течение 1 минуты и определяют активность фермента – лактатдегидрогеназы в прямой реакции (ЛДГпр, нмоль НАДН/мин) по формуле

,

где Е₃₄₀ – величина оптической плотности, измеренной при 340 нм и рассчитанной следующим образом: Е₃₄₀=|(E₁–E₂/2)|+|Е₂|

E₁=|Е₃₀-Е₀|; Е₂=|Е₆₀-E₀|;

3 – объем пробы в кювете в мл;

10⁹ – коэффициент пересчета моль в нмоль;

6,22×10⁶ – коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН);

t – время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.

Затем в спектрофотометрическую кювету помещают 2,8 мл 0,05М фосфатного буфера (pH 7,4), 0,05 мл 0,15 М раствора пировинограднокислого натрия, 0,1 мл 10 мМ восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и добавляют в смесь 0,05 мл гемолизата эритроцитов. Содержимое кюветы (3 мл) быстро перемешивают, измеряют величину его оптической плотности при 340 нм с интервалом 15 сек в течение 1 минуты и определяют активность фермента – лактатдегидрогеназы в обратной реакции (ЛДГобр, нмоль НАДН/мин) по формуле

,

где E₃₄₀ – величина оптической плотности, измеренной при 340 нм и рассчитанной следующим образом: Е₃₄₀=|(E₁–Е₂/2)|+|Е₂|

E₁=|Е₃₀-Е₀|; Е₂=|Е₆₀-Е₀|;

3 – объем пробы в кювете в мл;

10⁹ – коэффициент пересчета моль в нмоль;

6,22×10⁶ – коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН);

t – время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.

Затем вычисляют коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР) по формуле

КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100, где

ЛДГпр – активность прямой лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);

ЛДГобр – активность обратной лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);

100 – поправочный коэффициент.

Норма представлена кровью здоровых людей. У здоровых людей активность ЛДГпр составляет 56,23±0,35 нмоль НАДН/мин, активность ЛДГобр составляет 315,41±0,75 нмоль НАДН/мин, КБЭР равен 3,10±0,07. Затем сравнивают КБЭР ожоговых больных с КБЭР здоровых людей, и если показатель КБЭР у больного с ожогом выше показателя КБЭР здоровых людей, делают вывод о снижении метаболизма у пациентов.

Результаты исследования активности лактатдегидрогеназы в прямой и обратной реакциях (нмоль НАДН/мин) и величины коэффициента баланса энергетических реакций (КБЭР) в гемолизате эритроцитов 20 ожоговых больных представлены в таблице.

Активность лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин) и коэффициент баланса энергетических реакций в гемолизате эритроцитов в норме и при ожоге
	Здоровые, n=20	Больные с ожогом, n=20
	ЛДГпр	ЛДГобр	КБЭР	ЛДГпр	ЛДГобр	КБЭР
1	55,66	313,94	3	50,21	160,21	10
2	56,78	315,67	3	47,48	165,48	8
3	58,13	317,22	3	47,94	167,10	8
4	52,94	317,56	3	51,21	161,45	10
5	54,16	318,97	3	49,23	159,17	10
6	56,21	316,42	3	48,16	158,34	9
7	58,01	309,21	4	49,54	159,21	10
8	56,34	310,43	3	50,21	161,97	10
9	56,13	312,54	3	49,45	162,54	9
10	55,42	319,72	3	48,02	161,18	9
11	57,21	317,66	3	49,72	160,35	10
12	55,94	316,51	3	50,61	161,15	10
13	56,33	316,21	3	47,54	162,58	8
14	52,99	315,25	3	47,68	163,24	8
15	59,07	317,48	4	49,51	164,95	9
16	57,88	319,94	3	49,17	162,87	9
17	55,97	311,26	3	48,61	164,58	9
18	56,20	310,21	3	45,21	162,64	8
19	57,05	312,48	3	49,31	165,45	9
20	56,20	319,46	3	51,16	162,78	10
M±m	56,23	315,41	3,10	49,01	162,36	9,15
±0,35	±0,75	±0,07	±0,32	±0,52	±0,18
Примечания: ЛДГпр – активность лактатдегидрогеназы в прямой реакции, ЛДГобр – активность лактатдегидрогеназы в обратной реакции, КБЭР – коэффициент баланса энергетических реакций, n – количество людей.

Клинический пример

Будилов М.П., 25 лет, история болезни 200473, получил ожог пламенем на площади 45% поверхности тела. Спустя несколько часов после травмы взяли кровь из вены, стабилизировали ее 3,8% раствором цитрата натрия, приготовили гемолизат отмытых эритроцитов, 0,05 мл которого поместили в спектрофотометрическую кювету, содержащую 2,8 мл 0,05М глицин-щелочного буфера, 0,05 мл 0,45 М раствора молочнокислого натрия, 0,1 мл 0,8 мМ окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД), и измерили величину оптической плотности при длине волны 340 нм (Е₃₄₀) в течение 1 минуты с интервалом 15 секунд:

Время	0	15 сек	30 сек	45 сек	1 мин
Е340	0,100	0,134	0,152	0,185	0,200

Рассчитали величину оптической плотности при 340 нм за 1 минуту по формуле Е₃₄₀=|(E₁–Е₂/2)|+|Е₂|, где E₁ – величина оптической плотности, измеренная за 30 сек, Е₂ – величина оптической плотности, измеренная за 1 мин. Таким образом, Е₃₄₀=(0,052-0,050)+0,100=0,102.

После этого рассчитали активность фермента – лактатдегидрогеназы в прямой реакции – по формуле

,

где Е₃₄₀ – величина оптической плотности, измеренной при 340 нм за мин;

3 – объем пробы в кювете;

10⁹ – коэффициент пересчета моль в нмоль;

6,22×10⁶ – коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида;

t – время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.

Таким образом,

Затем 0,05 мл гемолизата эритроцитов поместили в спектрофотометрическую кювету, содержащую 2,8 мл 0,05 М фосфатного буфера, 0,05 мл 0,15 М раствора пировинограднокислого натрия, 0,1 мл 10 мМ восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), и измерили величину оптической плотности при длине волны 340 нм (Е₃₄₀) в течение 1 минуты с интервалом 15 секунд:

Время	0	15 сек	30 сек	45 сек	1 мин
Е340	0,800	0,740	0,620	0,580	0,500

Рассчитали величину оптической плотности при 340 нм за минуту по формуле Е₃₄₀=|(E₁–Е₂/2)|+|Е₂|, где E₁ – величина оптической плотности, измеренная за 30 сек, Е₂ – величина оптической плотности, измеренная за 1 мин. Таким образом, Е₃₄₀=(0,180-0,150)+0,300=0,330.

После этого рассчитали активность фермента – лактатдегидрогеназы в обратной реакции – по формуле

,

где Е₃₄₀ – величина оптической плотности, измеренной при 340 нм за мин;

3 – объем пробы в кювете;

10⁹ – коэффициент пересчета моль в нмоль;

6,22×10⁶ – коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида;

t – время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.

Таким образом,

Затем рассчитали коэффициент баланса энергетических реакций по формуле

КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100, где

ЛДГпр – активность прямой лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);

ЛДГобр – активность обратной лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);

100 – поправочный коэффициент.

Таким образом, КБЭР=(49,23/159,17)/(159,17/49,23)×100=10

Коэффициент баланса энергетических реакций у Будилова М.П. равен 10 и повышен по сравнению с КБЭР здоровых людей (равен 3), что свидетельствует о снижении у него интенсивности энергетического метаболизма.

Способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой простой и быстрый в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и большого количества биологического материала. Способ позволяет в ранние сроки определить нарушения энергетического метаболизма и возможные осложнения у больных с термической травмой.

Формула изобретения

Способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой путем исследования гемолизата крови, отличающийся тем, что в гемолизате эритроцитов ожоговых больных определяют активность фермента – лактатдегидрогеназы (прямой и обратной), вычисляют коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР) по формуле:
КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100,
где ЛДГпр – активность прямой лактатдегидрогеназы, нмоль НАДН/мин;
ЛДГобр – активность обратной лактатдегидрогеназы, нмоль НАДН/мин;
100 – поправочный коэффициент,
и если значение КБЭР ожоговых больных выше КБЭР здоровых людей, делают вывод о снижении энергетического метаболизма.