Патент на изобретение №2392858

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу инфекционных болезней. Для оценки тяжести течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом проводят исследование крови, а именно определяют содержание циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК). Среднетяжелую форму ГЛПС определяют при повышении уровня ЦЭК до 6,4-10,0×10⁴/л. Тяжелую форму заболевания без осложнений определяют при повышении уровня ЦЭК до 10,7-14,6×10⁴/л. Тяжелую форму ГЛПС с осложненным течением определяют при повышении уровня ЦЭК до 14,9-21,0×l0⁴/л на фоне выраженной клинической картины. Способ позволяет объективно и достоверно определить тяжесть течения геморрагической лихорадки, сокращает время анализа. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу инфекционных болезней, и может быть использовано для объективной оценки тяжести течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).

Известны следующие способы оценки тяжести течения ГЛПС, учитывающие динамику различных показателей:

1) способ оценки тяжести ГЛПС по степени выраженности основных клинических синдромов, наличия и продолжительности олигоанурии, уровня азотемии (креатинина и мочевины крови) и развития осложнений (заявка RU

2) способ оценки тяжести состояния больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом, заключающийся в том, что определяют показатель железоиндуцированной хемилюминесценции мочи (патент RU 2104533, 1998). Тяжелую степень состояния больных определяют при светосумме свечения в олигоанурическом периоде 8,54±1,5 ед., в полиурическом периоде 5,44±0,9 ед., а в периоде восстановительного диуреза 13,8±1,0 ед., среднетяжелую степень состояния больных определяют при светосумме свечения в олигоанурическом периоде 11,9±1,37 ед., полиурическом периоде 9,42±1,14 ед., периоде восстановительного диуреза 15,16±1,4 ед., легкую степень состояния больных определяют при светосумме свечения в олигоанурическом периоде 21,8±3,8 ед., в полиурическом периоде 17,7±2,94 ед., в периоде восстановительного диуреза 25,14±3,8 ед.

3) способ оценки тяжести течения по уровню концентрации простагландина Е₂ в плазме крови больных ГЛПС (патент RU 2155337, 2000). Недостатком этого метода является необходимость определения уровня простагландина Е₂ в тест-наборе и дороговизна.

Прототипом изобретения является способ оценки тяжести течения ГЛПС по уровню конечных стабильных метаболитов оксида азота (II) (NOx) в цельной крови (патент RU 2245552, 2005). Однако применение предложенного способа в клинической практике имеет определенные ограничения из-за значительной зависимости от других источников нитритов и нитратов, в том числе и пищевого происхождения.

д-ра мед. наук. – СПб., 1992, – 19 с). Вследствие повторяющихся циклов внутриклеточной репродукции хантавируса нарастает степень повреждения эндотелиоцитов с последующим отслоением их от базальной мембраны. Результатом изменения архитектоники внутренней выстилки сосудов является нарушение продукции эндотелиоцитами медиаторов, обеспечивающих в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов. Как следствие увеличивается проницаемость сосудистой стенки, усиливаются ее тромбогенность и адгезия лейкоцитов, нарушается тонус сосудов, и это является одной из причин взаимного усиления многочисленных «порочных кругов» в патогенезе геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

От точности оценки тяжести течения болезни зависит как адекватность и длительность терапии, так и возможность прогнозирования исхода заболевания, развития осложнений.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного и простого в применении метода оценки тяжести течения ГЛПС путем определения количества десквамированных циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) в периферической крови.

Технический результат при использовании изобретения – повышение точности и объективности способа, сокращение времени анализа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Определение циркулирующих в крови десквамированных эндотелиоцитов проводят методом J. Hladovec (Hladovec J. Circulating endothelial cells as a sign of vessel wall lesions / J.Hladovec / TPhysiol. Bohemoslov. – 1978. – Vol.27, 2. – P.140-144). Метод основан на выделении десквамированных клеток эндотелия сосудов вместе с тромбоцитами с последующим осаждением последних с помощью раствора аденозиндифосфата (АДФ). Кровь из локтевой вены берут натощак в количестве 5 мл. В качестве стабилизатора добавляют 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9. Для получения плазмы, богатой тромбоцитами, кровь сразу после взятия центрифугируют в течение 10 мин при 200g. Затем 1 мл плазмы смешивают с 0,2 мл раствора натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ-Na) в конечной концентрации 1 мг/мл. Полученную смесь механически перемешивают в течение 10 мин аккуратным встряхиванием пробирок, после чего вновь центрифугируют в прежнем режиме для удаления агрегатов тромбоцитов. Супернатант, свободный от тромбоцитов, переносят в другую пробирку и центрифугируют в течение 15 мин при 200g для осаждения эндотелиальных клеток. Затем надосадочную жидкость тщательно удаляют, а полученный осадок суспендируют стеклянной палочкой в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl. Готовой суспензией заполняют камеру Горяева и подсчитывают количество эндотелиоцитов в 2 сетках камеры методом фазово-контрастной микроскопии. Учитывая соотношение между количеством клеток в сетке и объемом камеры Горяева, объем плазмы и объем полученной суспензии, при подсчете количества эндотелиальных клеток результат умножают на 10⁴/л.

Повышение уровня ЦЭК до 6,4-10,0×10⁴/л оценивают как среднетяжелую форму ГЛПС; повышение уровня ЦЭК до 10,7-14,6×10⁴/л – как тяжелую форму заболевания без осложнений, повышение уровня ЦЭК до 14,9-21,0×10⁴/л на фоне выраженной клинической картины расценивают как тяжелую форму ГЛПС с осложненным течением.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности определения содержания десквамированных ЦЭК в периферической венозной крови для оценки тяжести течения ГЛПС. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Сравнение заявляемого решения не только с прототипом, но и с другими решениями в данной области медицинской науки показало, что оптимальным диагностическим методом является прямое измерение количества десквамированных эндотелиоцитов в крови больных ГЛПС, что позволяет оценить степень повреждения эндотелиальной выстилки сосудов, которая вовлекается в патогенез заболевания в самые ранние сроки. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

⁴/л (p<0,02), тяжелой без осложнений – 10,7±0,5×10⁴/л (p<0,001), тяжелой с осложнениями – 14,9±2,0×10⁴/л (p<0,001), то есть соответственно в 1,5; 2,5 и 3,5 раз выше контрольных значений. В олигоанурическом периоде среднетяжелой формы ГЛПС средний уровень ЦЭК составил 8,2±0,8×10⁴/л (p<0,001), тяжелой без осложнений – 12,3±1,5×10⁴/л (p<0,002), тяжелой с осложнениями – 15,1±2,6×10⁴/л (p<0,001), то есть соответственно в 2,0; 2,9; 3,6 раз выше контрольных значений. Анализ результатов исследования в полиурическом периоде заболевания показал, что уровень ЦЭК оставался статистически значимо выше контрольных значений (p<0,001): при среднетяжелой форме – 9,7±1,5×10⁴/л (в 2,3 раза выше, чем у здоровых), при тяжелой форме без осложнений – 14,6±1,8×10⁴/л (в 3,5 раза выше, чем у здоровых), при осложненном течении – 21,0±1,7×10⁴/л (в 5 раз выше, чем у здоровых). В периоде восстановленного диуреза отмечалось повышение уровня ЦЭК при среднетяжелой форме – 10,0±0,8×10⁴/л (р<0,001), что в 2,4 раза выше показателя в контрольной группе; статистически незначимое снижение при тяжелой форме без осложнений – 10,8±1,4×10⁴/л (p<0,001), что в 2,6 раза выше значений в группе контроля; осложненном течении – 5,2±1,6 (p>0,05). Высокий уровень десквамированных эндотелиоцитов в крови больных ГЛПС в период восстановленного диуреза при среднетяжелой форме и тяжелой форме без осложнений свидетельствует о незавершенности патологического процесса в организме даже в периоде клинического выздоровления. Видимую нормализацию уровня определяемых клеток в крови больных с осложненным течением в данный период заболевания необходимо объяснить тем, что значительная часть поврежденных эндотелиоцитов была слущена уже в предыдущий период заболевания, приведя тем самым к абсолютному уменьшению количества этих клеток в интиме сосудов, и статистически незначимое различие с контролем в данной ситуации не может быть свидетельством клинического выздоровления. Таким образом, по уровню ЦЭК можно судить о степени тяжести течения ГЛПС.

Таблица 1
Количество десквамированных эндотелиоцитов в крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии (×104/л)
периоды заболевания	формы заболевания
	среднетяжелая	тяжелая без осложнений	тяжелая с осложнениями
лихорадочный	6,4±0,6	10,7±0,5	14,9±2,0
р<0,02	р<0,001	р<0,001
	р1>0,05	р2>0,05
олиго-анурический	8,2±1,0	12,3±1,5	15,1±2,6
р<0,001	р<0,002	р<0,001
	р1>0,05	р2>0,05
полиурический	9,7±1,5	14,6±1,8	21,0±1,7
р<0,001	р<0,001	р<0,001
	р1>0,05	р2<0,05
восстановленного диуреза	10,0±1,8	10,8±1,4	5,2±1,6
р<0,001	р<0,001	р>0,05
	р1>0,05	р2<0,005
контроль	4,2±0,5
Примечание: р – достоверность различий с группой контроля; p1 – достоверность различий со среднетяжелой формой ГЛПС; р2 – достоверность различий с тяжелой формой ГЛПС без осложнений.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больной К., 15 лет, история болезни 11458/2010, поступил на 2-й день болезни с диагнозом: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. При поступлении состояние тяжелое, обусловленное выраженностью интоксикационного синдрома и лихорадкой. Жалобы при поступлении на боли в поясничной области, уменьшение количества мочи, боль в эпигастрии. В отделении у больного однократно была рвота. Олигурический период длился 5 дней со снижением суточного диуреза до 100 мл, подъемом креатинина до 200,0 мкмоль/л, мочевины – до 20,0 ммоль/л. Общий анализ крови: гемоглобин 159 г/л, эритроциты 5,26×10¹²/л, лейкоциты 10,8×10⁹/л, тромбоциты 112,0×10³/л, СОЭ 10 мм/ч. Анализ мочи: гипостенурия (уд. вес до 1003), протеинурия (до 1,315 г/л), микрогематурия (до 5-6-8 в поле зрения), лейкоцитурия (до 2-3-4 в поле зрения), цилиндрурия (зернистые – до 3-3-4; гиалиновые – до 4-3-4 в поле зрения). Перед выпиской показатели общеклинических анализов нормализовались. Уровень ЦЭК в крови определялся в динамике заболевания: 4×10⁴/л (лихорадочный период), 7×10⁴/л (олигурический период), 9×10⁴/л (полиурический период), 14×10⁴/л (период восстановленного диуреза). Клинический диагноз: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, среднетяжелая форма. МФА 1:256, 1:1024 (нарастание титров антител в 4 раза).

Пример 2. Больной К., 23 года, история болезни 12095/1735, поступил на 2-й день болезни с диагнозом: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. При поступлении состояние тяжелое, выраженные явления интоксикации, лихорадка, ломота в суставах, боль в поясничной области. Олигурический период длился 5 дней со снижением суточного диуреза до 100 мл. При поступлении в общем анализе крови: гемоглобин 139 г/л, эритроциты 4,47×10^12/л, лейкоциты 20,2×10⁹/л, тромбоциты 100×10⁹/л, СОЭ 15 мм/ч. В общем анализе мочи: гипостенурия (уд. вес 1000), протеинурия (до 2,457 г/л), клетки Дунаевского до 3-2-2 в поле зрения, эритроциты до 5-7-8 в поле зрения, лейкоциты до 5-6-6 в поле зрения, цилиндры: зернистые до 5-4-4 в поле зрения, гиалиновые до 1-10 в поле зрения, восковидные до 0-1-0 в поле зрения. В биохимическом анализе повышение креатинина определялось до 637,0 мкмоль/л, мочевины до 57,0 ммоль/л с последующим снижением к выписке: креатинина – до 102 мкмоль/л, мочевины – до 8,1 ммоль/л. Уровень ЦЭК в лихорадочном периоде составил 10×10⁴/л, олигурическом – 12×10⁴/л, полиурическом – 19×10⁴/л, восстановленного диуреза – 10×10⁴/л. Клинический диагноз: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, тяжелая форма. МФА 1:64; 1:1024. Таким образом, при тяжелой форме наблюдалось значительное повышение уровня десквамированных эндотелиальных клеток в крови.

Пример 3. Больной Ф., 54 года, история болезни 2007/20020, поступил на 5-й день болезни. При поступлении состояние крайне тяжелое, объективно: единичные петехии на передней грудной клетке, инъекция сосудов склер, энантема зева. Из анамнеза известно, что больной лихорадил все дни болезни, жаловался на боль в глазных яблоках, заложенность носа, боль в животе, пояснице, была рвота до 4-х раз. Больного по тяжести состояния госпитализировали в отделение гемодиализа. Олигурический период длился 7 дней со снижением суточного диуреза до 50 мл. В общем анализе крови: гемоглобин 133 г/л, эритроциты 4,14×10¹²/л, лейкоциты 22,7×10⁹/л, тромбоциты 273,0×10⁹/л, СОЭ 50 мм/ч. В общем анализе мочи в день поступления определялись: белок – 19,8 г/л, эритроциты в большом количестве в поле зрения, лейкоциты 20-22-25 в поле зрения, единичные зернистые цилиндры до 0-0-1 в поле зрения. В биохимическом анализе подъем креатинина определялся до 790,0 мкмоль/л, мочевины до 38,0 ммоль/л. Уровень ЦЭК в олигурическом периоде повысился до 15×10⁴/л, полиурическом – 25×10⁴/л, восстановленного диуреза – снизился до 6×10⁴/л. Учитывая клинику и результаты дополнительных методов исследования, выставлен клинический диагноз: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, тяжелая форма. Осложнения: Инфекционно-токсический шок I-II степени, ОПН, ДВС, гематома правой почки, острый эрозивный гастрит. РНИФ 1:1024; 1:1024. Таким образом, на фоне выраженной клинической картины уровень ЦЭК в олигурическом периоде определялся в 1,9 раз выше значений здоровых лиц, с постепенным повышением к полиурическому периоду – в 6 раз, восстановленного диуреза – в 1,4 раза.

Преимущество предлагаемого способа состоит в том, что определение уровня ЦЭК в крови просто в реализации, позволяет объективно и своевременно оценить тяжесть течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом и степень поражения эндотелия сосудов. Способ легко воспроизводим и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Формула изобретения

Способ оценки тяжести течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в периферической венозной крови определяют содержание циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) и повышение уровня ЦЭК до 6,4-10,0×10⁴/л оценивают как среднетяжелую форму ГЛПС; повышение уровня ЦЭК до 10,7-14,6×10⁴/л – как тяжелую форму заболевания без осложнений, повышение уровня ЦЭК до 14,9-21,0×10⁴/л на фоне выраженной клинической картины расценивают как тяжелую форму ГЛПС с осложненным течением.