Патент на изобретение №2392622

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ГИСТАМИНА В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЭНДОМЕТРИЯ МАТКИ КРЫС В ПРОЦЕССЕ ПОЛОВОГО ЦИКЛА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии. Для осуществления способа оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла проводят забор материала с последующим флуоресцентно-гистохимическим исследованием с использованием ортофталевого альдегида. При этом в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища крысы и сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса – 0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса – 0,72±0,12, позднего диэструса – 0,75±0,13, проэструса – 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора. При значениях содержания гистамина во влагалищном содержимом ниже контрольных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше – как повышенный. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии.

3-4). Установлено, что гистамин участвует в стимулированной эстрогенами пролиферации эпителиоцитов эндометрия (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н., 1981; Гунин А.Г. Эстроген-индуцированный гистогенез в матке при эндокринном дисбалансе. Авторефер. дис.3-4. – С.25-30). В связи с вышеизложенным определение уровня гистамина в эпителиальных клетках имеет важное клиническое значение.

4. – С.49-51). Дальнейший процесс исследования включает следующие этапы:

1. Изготовление криостатных срезов и монтирование их на покровных стеклах.

2. Выдерживание срезов в парах ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд. Стеклянный сосуд, содержащий ортофталевый альдегид и плотно закрытый крышкой, предварительно выдерживается в термостате в течение 10 минут.

3. Помещение срезов во влажную камеру (предварительно прогретый в течение 10 минут сосуд, содержащий на дне воду) в термостате при 100°С в течение 1 минуты.

4. Высушивание срезов в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.

5. Изучение полученных препаратов под люминесцентным микроскопом. По условиям этой реакции наибольшая концентрация гистамина дает желтое свечение при длине волны 515 нм (Сергеева В.Е. Люминесцентно-гистохимические методы и флуориметрия в морфологических исследованиях. – Чебоксары, 1985. – Деп. в ВИНИТИ. – 6358-85).

Для окончательной идентификации и количественного выражения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия препарат подвергается цитоспектрофлуориметрии при помощи фотометрической люминесцентной электронной насадки ФМЭЛ-1А для определения в условных единицах регистрирующего прибора концентрации гистамина в биологических структурах. Для определения интенсивности люминесценции гистамина в исследуемых объектах по традиционной методике используется интерференционный светофильтр 7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А (максимальная длина пропускаемой волны 503±14 нм). Световой поток люминесценции от изучаемого участка поля зрения отсекается автоматически аппаратным зондом и преобразуется ФЭУ в силу тока, которая вызывает отклонение стрелки стандартного измерительного прибора, что пропорционально концентрации гистамина под зондом.

К недостаткам указанного способа определения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки можно отнести:

1) негуманность и финансовую затратность, связанные с умерщвлением животного,

2) необходимость наличия криостата.

Технический результат предлагаемого нами способа заключается в том, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища экспериментального животного, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса – 0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса – 0,72±0,12, позднего диэструса – 0,75±0,13, проэструса – 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина ниже расчетных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше – как повышенный.

Описание сущности предлагаемого способа

Каждую фазу на протяжении полового цикла в утреннее время (в 9.00) с помощью металлической петли осуществляется забор влагалищного содержимого крысы. Полученное содержимое размазывается на 2 предметных стеклах (мазок 1 и мазок 2).

Последовательность дальнейшего приготовления препаратов

1. Выдерживание мазка 1 в стеклянном сосуде с парами ортофталевого альдегида, а мазка 2 в аналогичном сосуде без ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд.

2. Помещение мазков в раздельные влажные камеры, предварительно прогретые в течение 10 минут, в термостате при 100°С в течение 1 минуты.

3. Высушивание мазков в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.

Изучение полученных препаратов осуществляется под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-2А. С помощью интерференционного светофильтра 7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А определяются средние уровни специфической люминесценции мазка 1 (величина А) и аутолюминесценции мазка 2 (величина В) в условных единицах регистрирующего прибора.

Концентрация гистамина в содержимом влагалища определяется по разнице величин А и В. Результаты представлены в таблице 1.

У этих же крыс во время эфирного наркоза извлекалась матка, из тела которой изготавливались криостатные срезы. Полученные криостатные срезы обрабатывались в соответствии с методом Кросса-Эвена-Роста. Микроспектрофлуориметрически в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия определена средняя концентрация гистамина в каждую фазу полового цикла (таблица 2).

В результате рангового корреляционного анализа Спирмена установлена высокая положительная сопряженность (R=0,829) изменений концентраций гистамина в содержимом влагалища с колебаниями концентрации этого биоамина в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия.

Ниже приводятся 2 примера определения уровня гистамина в эпителиоцитах эндометрия по результатам исследования влагалищных мазков.

Пример 1

Крыса 1

Поля зрения		ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
1	0,40	0,35	0,70	0,75	0,80	1,10
2	0,55	0,35	0,60	0,85	0,70	0,80
3	0,45	0,40	0,65	0,75	0,65	0,80
4	0,40	0,35	0,55	0,65	0,70	0,75
5	0,55	0,30	0,60	0,60	0,60	0,85
6	0,55	0,30	0,70	0,60	0,80	0,80
7	0,55	0,25	0,65	0,80	0,80	0,80
8	0,45	0,35	0,60	0,80	0,80	0,80
9	0,60	0,30	0,75	0,60	0,60	1,00
10	0,50	0,30	0,70	0,80	0,70	0,85
Средняя концентрация		0,500±0,0671	0,325±	0,650±	0,72±	0,715±	0,855±
0,0403	0,0592	0,0923	0,0776	0,1036

Сравнение полученных результатов с данными, представленными в таблице 1, показывает их сходство, что позволяет оценивать уровень гистамина в эпителиоцитах эндометрия матки крысы 1 как соответствующий его нормальному содержанию в течение полового цикла.

Пример 2

Крыса 2

Поля зрения		ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
1	0,60	0,50	0,90	1,05	0,95	1,10
2	0,75	0,50	0,80	0,85	1,00	1,00
3	0,65	0,60	0,85	1,00	1,00	1,20
4	0,60	0,50	0,80	0,95	0,95	1,10
5	0,55	0,30	0,60	0,60	0,60	0,85
6	0,75	0,50	0,80	0,90	1,00	1,20
7	0,75	0,65	0,75	0,80	0,80	0,90
8	0,65	0,55	0,85	0,80	0,80	1,00
9	0,60	0,50	0,90	0,90	1,00	1,00
10	0,70	0,50	0,90	1,10	1,05	1,00
Средняя концентрация		0,680± 0,064	0,530±	0,825±	0,925±	0,945±	1,050±
0,051	0,064	0,096	0,082	0,092

Результаты этого исследования показывают во все стадии полового цикла большее содержание гистамина в содержимом влагалища по сравнению с контрольными данными.

Таблица 1
Содержание гистаминов в мазках содержимого влагалища крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)
	ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
Гистамин	0,507±0,069	0,341±0,036	0,683±0,080	0,722±0,121	0,749±0,130	0,865±0,114

Таблица 2
Содержание гистамина в эпителиоцитах эндометрия тела матки крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)
	ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
ЭП	3,198±0,47	2,765±0,36	2,710±0,42	3,672±0,45	6,060±0,44	6,945±0,94
ЭЖ	3,348±0,48	3,058±0,33	2,945±0,41	3,769±0,92	5,963±0,60	7,616±0,77
ЭП – эпителиоциты покровные, ЭЖ – эпителиоциты железистые

Формула изобретения

Способ оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла, включающий забор материала с последующим флуоресцентно-гистохимическим исследованием с использованием ортофталевого альдегида, отличающийся тем, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища крысы, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса -0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса – 0,72±0,12, позднего диэструса – 0,75±0,13, проэструса – 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина во влагалищном содержимом ниже контрольных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше – как повышенный.