Патент на изобретение №2392328

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК ИЗ ДРОЖЖЕЙ

(57) Реферат:

Способ предусматривает суспендирование дрожжей в водном 2-3%-ном растворе додецилсульфата натрия. Суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре. К слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М. Суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре. Центрифугируют на низкоскоростной центрифуге без охлаждения. Полученный шрот промывают последовательно двумя порциями 2-3 М раствора NaCl и двумя порциями 92-96%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования. Из полученного шрота РНК экстрагируют дистиллированной водой с последующим осветлением раствора путем фильтрования его через стеклянный пористый фильтр. Способ позволяет получить высокополимерную РНК, освобожденную от примесного высокомолекулярного рибопротеогликана. 4 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к выделению физиологически активных соединений.

Известные способы выделения РНК из дрожжей позволяют получать низкополимерную РНК (патент РФ 2103365, патент РФ 3 (121), c.117-121) [4].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их в 2%-ном водном растворе литического агента – додецилсульфата натрия (ДДС-Na), содержащем 4,5%-ный этанол, 0,0125 М NaH₂PO₄ и 0,0125 М Na₂HPO₄

3 (121), с.117-121) [4].

Целью изобретения является освобождение высокополимерной РНК от примесного высокомолекулярного рибопротеогликана, что достигается заменой «жесткого» центрифугирования по способу-прототипу на стадии осаждения высокополимерной РНК хлористым натрием (2000 g, 1 ч, охлаждение) на более «мягкое» центрифугирование (1500 g, 10 мин, без охлаждения). Осуществить такую замену нам удалось перенеся процедуру освобождения высокополимерной РНК от балласта с одной из первых стадий (см. способ-прототип, стадия осветления) на самую последнюю стадию, поскольку известно – чем больше осадок, тем при меньшем ускорении и меньшем времени центрифугирования его можно количественно осадить.

Цель достигается тем, что дрожжи суспендируют в водном 2-3%-ном растворе ДДС-Na, суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре, к слитой с помощью сифона надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют (1000-2000 g, 5-15 мин, без охлаждения), осадок промывают двумя порциями 2-3 М раствора NaCl и двумя порциями 92-96%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и центрифугирования (1000-2000 g, 5-15 мин, без охлаждения). Из полученного шрота (высокополимерная РНК плюс балласт) высокополимерную РНК экстрагируют дистиллированной водой, экстракт осветляют фильтрованием и лиофилизуют.

При снижении центробежного ускорения ниже 1000 g и времени центрифугирования менее 5 мин осадок высокополимерной РНК образуется рыхлый и плохо садится, а увеличение ускорения выше 2000 g и времени центрифугирования более 15 мин не приводит к дополнительному его образованию. Кроме того, при ускорении 2000 g и выше вместе с крупными хлопьями высокополимерной РНК соосаждается мелкая муть мало изученного высокомолекулярного рибопротеогликана.

Пример осуществления предлагаемого способа

День 1 – экстракция РНК. 1 кг свежих прессованных пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae. Новосибирский дрожжевой завод, ТУ 9182-001-00367108-04) с содержанием влаги ~70% суспендировали по порциям в течение 20 мин в 2 л кипящей дистиллированной воды, содержащей 75 г ДДС-Na (Научно-производственной фирмы «ДИА-ФАРМ», г.Белгород) так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 98°С. Суспензию кипятили 40 мин при 98-102°С и частом перемешивании. По мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 3 л. По окончании экстракции в горячую суспензию добавляли кипящую воду до 4,5 л, перемешивали, переносили в узкую цилиндрическую емкость на 5 л из термостойкого стекла, в которой она и отстаивалась при комнатной температуре в течение 22 ч.

День 2 – высаливание РНК. Отстоявшийся супернатант (2,8 л) сливали с помощью сифона в стеклянную емкость на 5 л, добавляли в нее 810 г NaCl (ГОСТ Р 51574-2000, ФГУП комбината «СИБСОЛЬ, г.Усолье-Сибирское, Иркутская обл.) и кипяченую воду до 4,5 л. Суспензию интенсивно перемешивали до полного растворения соли и оставляли при комнатной температуре на 22 ч. При этом в нижней части суспензии формируется осадок, а на ее поверхности укрупняются пузырьки высоленного воздуха.

День 3 – промывка высоленной РНК 3 М раствором NaCl и этанолом. Укрупненные пузырьки высоленного воздуха удаляли с поверхности суспензии легким постукиванием по верхней части стеклянной емкости или легким помешиванием верхней части суспензии. Далее, высоленный осадок-шрот, содержащий высокополимерную РНК, отделяли от супернатанта центрифугированием (1500 g, 10 мин, без охлаждения), промывали двумя порциями по 2 л 3 М раствора NaCl и 2-мя порциями (1 и 0,5 л) 94%-ного этанола (Куйбышевский спиртовый завод, Новосибирская обл.); при этом шрот отделяли от 3 М раствора NaCl и этанола центрифугированием (1500 g, 10 мин, без охлаждения).

Товарную высокополимерную РНК получали экстракцией ее из промытого шрота дистиллированной водой, осветлением экстракта фильтрованием через стеклянный пористый фильтр «ПОР-100» и заключительной лиофилизацией.

Из 1 кг свежих прессованных пекарских дрожжей получали 5-10 г высокополимерной РНК со следующими характеристиками: цвет лиофилизованного препарата – белый; растворимость в воде – хорошая; весовая экстинкция, ОЕ₂₆₀/мг – 19-21; содержание КРФ, % 2,5; прирост КРФ, % 0,5; спектральные отношения: D₂₃₀/D₂₆₀ – 0,35-0,55; D₂₅₀/D₂₆₀ – 0,86-0,94; D₂₈₀/D₂₆₀ – 0,4-0,55.

Предложенный способ получения высокополимерной дрожжевой РНК (предполагаемое рыночное название «Виталанг-1») является простой и легко масштабируемой технологией, поскольку в нем используются только самые низкоскоростные центрифуги без охлаждения и крупнотоннажный литический агент – ДДС-Na.

Источники информации

1. Патент РФ 2103365.

2. Патент РФ 1708845.

3 (121), с.117-121.

Формула изобретения

1. Способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их в кипящем растворе литического агента додецилсульфата натрия (ДДС-Na) с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием и промывкой осадка раствором хлористого натрия и этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой, отличающийся тем, что дрожжи суспендируют в водном 2-3%-ном растворе додецилсульфата натрия (ДДС-Na), суспензию выдерживают при 98-102°С в течение 40-60 мин, отстаивают горячий лизат в течение 20-24 ч при комнатной температуре, к слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М, суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют на низкоскоростной центрифуге без охлаждения, полученный шрот промывают последовательно 2-3 М раствором NaCl и 92-96%-ным этанолом путем его ресуспендирования при комнатной температуре и низкоскоростного центрифугирования.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отстаивание горячего лизата проводят предварительно разбавив его кипяченой водой в соотношении дрожжи/вода 1/3-4.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкоскоростное центрифугирование осуществляют при ускорении 1000-2000 g в течение 5-15 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывание шрота осуществляют последовательно не менее чем двумя порциями 2-3 М раствором NaCl и 92-96%-ным этанолом.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечную экстракцию высокополимерной РНК из шрота производят дистиллированной водой с последующим осветлением раствора путем фильтрования его через стеклянный пористый фильтр.