Патент на изобретение №2392311
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ STREPTOALLOTEICHUS CREMEUS SUBSP. TOBRAMYCINI ВКПМ S-1084 – ПРОДУЦЕНТ АПРАМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АПРАМИЦИНА
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве апрамицина, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами. Способ предусматривает культивирование штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 продуцента апрамицина. Выделение ампрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака. Полученный элюат концентрируют в вакууме и осаждают избытком ацетона апрамицин в форме сульфата. Изобретение позволяет повысить выход апрамицина. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение касается нового штамма-продуцента антибактериального антибиотика апрамицина из группы аминогликозидов и способа получения апрамицина сульфата. Особое значение аминогликозидов в современной антибиотикотерапии бактериальных инфекций обусловлено их высокой активностью в отношении грамотрицательных микроорганизмов, удельный вес которых в этиологии гнойно-септических процессов постоянно возрастает Известен штамм Streptoalloteichus cremeus var. tobramycini var. nov. 2242 – продуцент аминогликозидных антибиотиков небрамицинового комплекса [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания апрамицина в культуральной жидкости (не более 0,8 г апрамицина в 1 л культуральной жидкости), где он образуется наряду с другими антибиотиками аминогликозидного комплекса – карбамоилтобрамицином, карбамоилканамицином В в соотношении 2:1:1, соответственно. Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент апрамицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия ультрафиолетовых лучей и нитрозометилбиурета на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и апрамицин в качестве селективных агентов. Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП S-1084. Штамм 1084 обладает повышенной продуктивностью – (4 г в 1 л культуральной жидкости) апрамицина, синтезирует антибиотик в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками. Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма 1084. Температура (20-37)°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культурой штамма, выращенной на глицерин-нитратной агаровой среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (см.таблицу).
Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные, спирали растянутые, с 2-6 оборотами, поверхность спор гладкая. Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений pH (5,0-10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу и инозитол, умеренно рамнозу и глюкозу, слабо использует сахарозу и лактозу, не использует раффинозу, арабинозу, манит, ксилозу и целлюлозу. Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена. Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре Штамм 1084 поясняется следующим примером. Пример. Для получения спорового материала культуру Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1084 выращивают в течение 7 дней при 37°С на глицерин-нитратной агаровой Линденбайна следующего состава, %:
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 1,0 атм и 120°С. Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:
Посевной материал выращивают при 37°С в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки 200-240 об/мин. Количество посевного материала для инокуляции 5-7%. Ферментация проводится на качалке при 37°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:
Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633. Содержание апрамицина в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации (через 144 часа) составляет 4000 мкг/мл. Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является способность к биосинтезу апрамицина в виде монокомпонента и в 5 раз повышенная продуктивность антибиотика, а именно содержание апрамицина в культуральной жидкости штамма-прототипа 800 мкг/мл в составе комплекса аминогликозидов, а в заявленном штамме – 4000 мкг/мл. С целью выделения апрамицина проводят его сорбцию из нативного раствора (обработанной щавелевой кислотой и отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) с pH 6,7-6,9 на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом. Десорбцию апрамицина проводят путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака. Элюат концентрируют в вакууме, добавляют (24,0-25,2)%-ный раствор серной кислоты до pH 6,0 и апрамицина сульфат осаждают добавлением избытка ацетона. Апрамицина сульфат, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1084, представляет собой белый порошок (допускается коричневатый оттенок), хорошо растворим в воде и нерастворим в органических растворителях. По своим физико-химическим свойствам (данные 13С-ЯМР, значения Rf при тонкослойной хроматографии и электрофоретическая подвижность при электрофорезе на бумаге в электролитах в области pH (1,7-2,5), антибактериальной активности (650 мкг/мг) и токсичности (LD50 составляет 220 мг/кг при внутривенном введении мышам) полученный апрамицина сульфат полностью соответствует апрамицину, описанному в литературе. Брутто-формула: C21H41N5O11. H2SO4. Мол. масса = 637,6 а.е.м. Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=540 (МН)+. [ Выход целевого продукта 73,0% от его содержания в культуральной жидкости. Таким образом, создан новый мутантный штамм Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования монокомпонентного апрамицина, которая в 4 раза превосходит активность штамма-прототипа 2242-ЛБ. Антибиотическая активность нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 составляет 4000 мкг/мл. Использование нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 как продуцента для биосинтеза апрамицина позволяет увеличить выход целевого продукта при выделении апрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухкомпонентным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака, концентрацией в вакууме и осаждением в форме сульфата. ЛИТЕРАТУРА
Формула изобретения
1. Штамм Streptomyces cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 – продуцент апрамицина. 2. Способ получения ампрамицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084, выделение ампрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н. аммиака, концентрацию в вакууме и осаждение в форме сульфата.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 Гаузе
]20