Патент на изобретение №2391396
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082 – ПРОДУЦЕНТ ЛИНКОМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИНКОМИЦИНА
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве антибактериального антибиотика линкомицина гидрохлорида, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми, и некоторыми анаэробами. Способ предусматривает культивирование штамма Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082, продуцента линкомицина на питательной среде заданного состава, экстракцию линкомицина органическими растворителями из нативного раствора, реэкстракцию линкомицина с последующим выделением. Полученный экстракт концентрируют и кристаллизуют с получением линкомицина в форме гидрохлорида. Изобретение позволяет повысить выход линкомицина. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента антибактериального антибиотика линкомицина и способа его получения. Антибиотик линкомицин эффективен при лечении заболеваний, вызванных грамположительной микрофлорой и не поддающихся лечению другими антибиотиками. Особенно эффективен линкомицин при лечении остеомиелитов, поскольку антибиотик избирательно накапливается в костной ткани. Линкомицин эффективен в отношении метициллин-резистентных штаммов стафилококков и является ценным препаратом для лечения тяжелых травматических и гнойно-септических больных. Линкомицин является также сырьем для получения терапевтически более активного полусинтетического препарата клиндамицина. Известен штамм Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент линкомицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей 60Co на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин, рифамицин и блеомицин в качестве селективных агентов. Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером S-1082. Штамм 1082 обладает повышенной продуктивностью линкомицина (4800 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками. Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКПМ S-1082. Температура 28°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенной на минеральном агаре Морфологические признаки. Спороносцы прямые, цепочки спор прямые, споры овальные с гладкой поверхностью. Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С, и в диапазонах значений pH (6,0-9,0) с оптимумом pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу, арабинозу, ксилозу, инозит; фруктозу, лактозу, галактозу, сахарозу, рамнозу; слабо использует маннит и рафинозу. Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или в виде зрелой культуры на агаровой среде под вазелиновым маслом при (5-7)°С. Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре Штамм S-1082 поясняется следующим примером. Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces roseolus S-1082 выращивают в течение (7-10) суток при 37°С на агаровой среде
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,6 атм при 120°С. Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:
Посевной материал выращивают при 28°С в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки (200-240) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции – 5%. Ферментация проводится на качалке при 28°С на среде (50 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:
Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633. Содержание линкомицина в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации (через 144 часа) составляет 4800 мкг/мл. Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является фагоустойчивость и более чем в 8 раз повышенная продуктивность, а именно – содержание линкомицина в культуральной жидкости штамма-прототипа – 558 мкг/мл, а в заявленном штамме – 4800 мкг/мл. С целью выделения линкомицина проводят его экстракцию н-бутанолом из нативного раствора (обработанной щавелевой кислотой и отфильтрованной культуральной жидкости штамма-продуцента Streptomyces roseolus S-1082) с pH=10,0 с последующим переводом линкомицина в водный раствор соляной кислоты и реэкстракцией н-бутанолом. Бутанольный экстракт с добавлением 2 н. раствора хлористого водорода в ацетоне при pH=2,0 концентрируют и линкомицин кристаллизуют в форме гидрохлорида. Линкомицина гидрохлорид, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptomyces roseolus S-1082, представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, метаноле, ограниченно – в этаноле и нерастворим в других органических растворителях. По физико-химическим свойствам, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует требованиям ВФС. Брутто-формула: C18H34N2O6S·HCl. Мол. масса 443.04 а.е.м. Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=407(MH)+ ИК-спектр (KBr), Выход готового продукта – линкомицина гидрохлорида – составляет 42% от содержания линкомицина в культуральной жидкости продуцента. Таким образом, создан новый мутантный штамм Streptomyces roseolus S-1082, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования, которая более чем в 8 раз превосходит активность штамма-прототипа ЛИТЕРАТУРА 1. SU, авторское свидетельство СССР
Формула изобретения
1. Штамм Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082 – продуцент линкомицина. 2. Способ получения линкомицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082, экстракцию линкомицина органическими растворителями из нативного раствора, реэкстракцию линкомицина с последующим его выделением, концентрацией и кристаллизацией в форме гидрохлорида.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1146 Actinomyces roseolus – продуцент антибиотика линкомицина [1]. Недостатком данного штамма является фагочувствительность и низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости.
max, см-1: 3440, 3330, 3280, 3040, 3015, 2940, 2910, 2860, 1672, 1657, 1566, 1475, 1459, 1445, 1409, 1358, 1263, 1230, 1207, 1143, 1107, 1092, 1078, 1044, 996, 963, 906, 871, 802, 738, 718;