Патент на изобретение №2391345

(54) ДИГИДРОХЛОРИД 1-(3-МОРФОЛИНОПРОПИЛ)-2-ФЕНИЛИМИДАЗО[1,2-a]-БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВА АНТАГОНИСТА ПУРИНОВЫХ P2Y1-РЕЦЕПТОРОВ, АНТИАГРЕГАНТНУЮ И АНТИТРОМБОТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

(57) Реферат:

Изобретение относится к дигидрохлориду 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I:

,

проявляющему свойства антагониста пуриновых P2Y₁-рецепторов, антиагрегантную и антитромботическую активность. Технический результат – получение нового соединения, которое может найти применение в медицине для создания лекарственного препарата для терапии заболеваний, сопровождающихся увеличением тромбогенного потенциала крови: атеросклероза, ишемической болезни сердца, диабетической ангиопатии. 5 табл.

Изобретение относится к новому 1,2-дизамещенному имидазо[1,2-а]бензимидазола, а именно к водорастворимому дигидрохлориду 1-(3-морфолинонопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I:

,

проявляющему P2Y₁-антагонистические, антиагрегантные и антитромботические свойства, который может стать основой для создания лекарственного препарата для терапии заболеваний, сопровождающихся увеличением тромбогенного потенциала крови: атеросклероза, ишемической болезни сердца, диабетической ангиопатии.

15. – С.1053-1056), диабетической ангиопатии (Балаболкин М.И. Диабетология. – М., 2000. – 672 с.).

В настоящий момент установлено, что на мембране тромбоцитов имеются три подтипа пуринорецепторов: P2X₁, P2Y₁ и P2Y₁₂. P2Y₁₁₂-рецепторов: тиклопидин и клопидогрель (Регистр лекарственных средств России. РЛС Энциклопедия лекарств. Выпуск 15. – Издательство: РЛС-2007. – 2006. – С.1488).

14. – С.32-38).

Таким образом, поиск новых безопасных и высокоэффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов являются актуальными для современной медицины.

Наиболее близким по структуре является дигидрохлорид 1-(2-морфолиноэтил)-2-трет-бутилимидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющий в том числе антиагрегантную активность (патент США 5639756, C07D 487/00, 1987 г.).

В ряду 1,2-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола неизвестны соединения, проявляющие одновременно свойства антагонистов пуриновых P2Y₁-рецепторов, антитромботическую и антиагрегантную активность.

Техническим результатом изобретения является новое соединение в ряду 1,2-дизамещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющее наряду с антиагрегантной активностью новые для данного ряда свойства, а именно P2Y₁-антагонистическую и антитромботическую активность.

Технический результат изобретения достигается дигидрохлоридом 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I.

Синтез соединения заключается во взаимодействии гидрохлорида 1-(3-хлорпропил) – (способ А) или гидробромида 1-(3-бромпропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (способ Б) с морфолином. Можно также получить это соединение в результате реакций 1-фенацил-2-хлорбензимидазола (способ В) или 1-фенацилбензимидазол-2-сульфокислоты (способ Г) с 3-морфолинопропиламином. Полученное одним из этих способов основание затем переводят в водорастворимый дигидрохлорид I обычными методами, используя концентрированную HCl или ее растворы в изопропиловом спирте или эфире.

Ниже приведены методики синтезов предлагаемого соединения:

Пример. Дигидрохлорид 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (I).

А. Смесь 3,46 г (10 ммоль) гидрохлорида 2-фенил-1-(3-хлорпропил)-имидазо[1,2-а]бензимидазола (Анисимова В.А., Спасов А.А., Левченко М.В., Александрова Е.А.. Хим.-фарм. ж., 1995, 10, с.18) и 10 мл морфолина кипятят 4 ч. Охлаждают, выливают в воду и экстрагируют хлороформом. Экстракт пропускают через слой оксида алюминия, элюируя 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазол хлороформом. После упаривания элюата остается густое масло (3,2 г, 88,9%), которое обрабатывают эфирным раствором HCl. Выпавший белоснежный осадок дигидрата дигидрохлорида отфильтровывают, сушат при 110°С. Выход 3,4 г (88,5%). Т.пл. 180-181°С (разл., из спирта).

Найдено, %: С 56,7; Н 6,5; Cl 15,2; N 12,1.

C₂₂H₂₄N₄O·2 HCl·2 H₂O.

Вычислено, %: С 56,3; Н 6,4; Cl 15,1; N 11,9.

Спектр ПМР (DMSO-d₆+CCl₄), , м.д.: 2,94 (2Н, кв., СН₂СН₂СН₂); 3,17 (4Н, т., O(СН₂)₂); 3,26 (2Н, т., NCH₂); 3,95 (4Н, т., N(CH₂)₂); 4,40 (2Н, т., N_ArCH₂); 7,30-7,75 (8Н, м., H_Ar); 7,90 (1Н, д., 6-Н); 8,04 (1Н, д., 7-Н); 8,28 (1Н, с., 3-Н); N⁺H в обмене.

ИК-спектр (вазел. масло), см^-1: 1660 (C=N⁺<), 2500-2730 (N⁺H, широкая полоса), 3200-3470 (N⁺Н, широкая полоса).

Б. Кипятят 2,93 г (7,5 ммоль) гидробромида 2-(3-гидроксипропиламино)-1-фенацилбензимидазола (Анисимова В.А., Спасов А.А., Левченко М.В., Александрова Е.А. Хим.-фарм. ж., 1995, 10, с.18) в 30 мл 48% HBr (т.кип. 127°С) 5-6 ч. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. Получают 3,0-3,16 г (92-97%) практически чистого гигроскопичного гидробромида 1-(3-бромпропил)-2-фенилимидазо [1,2-а]бензимидазола. Вода теряется при высушивании соли при 110-115°С. Белоснежные блестящие иголочки, т.пл. 213-214°С (разл., этанола).

Найдено, %: С 49,5; Н 3,8; Br 36,8; N 9,9.

C₁₈H₁₆BrN₃·HBr.

Вычислено, %: С 49,7; Н 3,9; Br 36,7; N 9,7.

Спектр ¹Н ЯМР (DMSO-d₆ – CCl₄), , м.д.: 2,31 (2Н, кв., J₁ 13,77, J₂ 7,25, -CH₂-); 3,46 (2Н, т., J 6,37, CH₂Br); 4,48 (2Н, т., J 4,48, NCH₂); 7,38-7,65 (7H, м., H_Ar); 7,78 (1Н, д., J 4,44, 6-Н); 8,10 (1Н, м., J 3,95, 7-Н); 8,38 (1Н, с, 3-Н); N⁺Н в обмене.

ИК-спектр (вазелин, масло), см^-1: 1500, 1595, 1605 (С=С), 1665 (С=N⁺<).

Смесь 1,3 г (3 ммоль) полученного гидробромида 1-бромпропил-замещенного и 5 мл морфолина кипятят 1-1,5 ч. Морфолин испаряют, остаток обрабатывают водой, осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат на воздухе, получая 0,86-0,92 г (79,9-85,4%) основания 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола. После кристаллизации из изооктана и высушивании при 75-80°С т.пл. его 107-108°С.

Найдено, %: С 73,4; Н 6,7; N 15,7.

C₂₂H₂₄N₄O.

Вычислено, %: С 73,3; Н 6,7; N 15,5.

Дигидрохлорид, идентичный описанному в методе А, получен подкислением ацетонового раствора вышеописанного основания конц. HCl.

В. Смесь 4,05 г (15 ммоль) 1-фенацил-2-хлорбензимидазола [Кочергин П.М., Пономарь B.C. Способ получения производных имидазо[1,2-а]бензимидазола. Авт. свид. 230827 (1968)] и 6,49 г (45 ммоль) 3-морфолинопропиламина нагревают до 150-155°С и выдерживают при этой температуре 2 часа. Охлаждают, вливают в воду и выделившийся осадок экстрагируют хлороформом. Экстракт пропускают через колонку с оксидом алюминия (элюент – хлороформ). Полукристаллическое масло, оставшееся после испарения хлороформа из элюата и представляющее собой 1-морфолинопропил-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазол, переводят в дигидрохлорид I, как описано выше в методике А, получая 5,68 г (81,9%) дигидрата соли.

Г. Смесь 10 ммоль бензимидазол-2-сульфокислоты и 20 ммоль КОН в 5 мл воды нагревают до образования раствора. После охлаждения к полученному раствору приливают 30 мл ацетона, выпавший белый осадок дикалиевой соли бензимидазол-2-сульфокислоты отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают на воздухе. Выход 80-85%.

Суспензию 4,11 г (15 ммоль) полученной дикалиевой соли и 2,98 г (15 ммоль) фенацилбромида в 15 мл диметилформамида перемешивали при 90-100°С 3 ч. Смесь охлаждали, разбавляли водой и подкисляли конц. HCl до рН 1. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали холодной водой и ацетоном. Выход 4,0 г (85%).

Смесь 1,58 г (5 ммоль) 1-фенацилбензимидазол-2-сульфокислоты и 2,16 г (15 ммоль) 1-(3-аминопропил)морфолина нагревают при перемешивании при 140-150°С 1 ч. По охлаждении реакционную массу обрабатывают водой и экстрагируют 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазол хлороформом. Далее поступают так, как описано в методике В. Выход 1,85-1,90 г (79-81%).

Фармакологические свойства соединения I.

А. P2Y₁-антагонистическая активность соединения I на тромбоцитах in vitro

.3. – С.65-69).

Эксперименты проводили на лазерном анализаторе малоуглового светорассеяния «Лайт-скан» («Люмекс ЛТД», Россия) в солевой среде, содержащей 140 мМ NaCl; 10 мМ трис-HCl буфера; 5 мМ ЭДТА (рН 7,8), с разбавлением плазмы, обогащенной тромбоцитами (концентрация тромбоцитов не превышала 10⁷ клеток/мл). Для экспериментов использована плазма 6 кроликов породы «Шиншилла» массой 4-4,5 кг. В качестве индукторов активации тромбоцитов использовались динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Реанал», Венгрия) и селективный агонист P2Y₁-рецепторов 2-метилтио-АТФ («Sigma», США). В качестве препарата сравнения взят тиклопидин (Тиклид, “Sanofi-syntelabo”, Франция).

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием парного критерия Стьюдента при предварительной проверке выборки на нормальность распределения.

Соединение I в концентрации 10^-6 М достоверно подавляло АДФ-индуцированную активацию тромбоцитов в бескальциевой среде на – 22,1±2,1%, в то время как тиклопидин не проявил ингибирующей активности.

При использовании в качестве индуктора активации тромбоцитов селективного P2Y₁-агониста 2-метилтио-АТФ, соединение I в концентрациях 10^-4-10^-5 М выраженно подавляло активацию тромбоцитов (табл.1), в отличие от тиклопидина, показавшего статистически незначимый эффект.

Б. Влияние соединения I на агрегацию тромбоцитов в условиях ex vivo

10. – С.15-18) на образцах плазмы 36 половозрелых нелинейных белых крыс обоего пола массой 270-320 г. В качестве индукторов агрегации использовали АДФ («Реанал», Венгрия) (5 мкМ) и коллаген (“Sigma”, США) (50 мг/кг). Исследуемое соединение I и препарат сравнения тиклопидин (Тиклид, “Sanofi-syntelabo”, Франция) вводили перорально в дозе, эквимолярной 6 мг/кг тиклопидина, за 2 часа до забора крови под эфирным наркозом.

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием критерия Манна-Уитни.

При исследовании влияния на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов обнаружено, что по угнетению степени агрегации соединение I превосходит тиклопидин в 2,4 раза, а по влиянию на скорость агрегации – в 1,9 раз (табл.2).

Исследование влияния на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов обнаружило, что по угнетению степени агрегации соединение I незначительно превосходит тиклопидин (табл.3).

В. Антитромботические свойства соединения I

Исследуемое соединение I и препарат сравнения тиклопидин (Тиклид, “Sanofi-syntelabo”, Франция) вводили перорально в дозе, эквимолярной 6 мг/кг тиклопидина, за 2 часа до моделирования тромбоза. Воспроизведение моделей артериальных тромбозов проводили под нембуталовым (35 мг/кг) наркозом с регистрацией уровня кровотока с помощью ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К» («СП Минимакс», С.-Петербург, Россия).

Антитромботическую активность изучали на 38 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах массой 330-440 г. Для моделирования генерализованного тромбоза использовали 35 белых нелинейных мышей – самцов массой 20-26 г.

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием критерия Манна-Уитни, ANOVA (Newman-Keuls test) и точного критерия Фишера.

На модели артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа, у крыс, получивших однократно соединение I, снижение уровня кровотока на 50% по сравнению с параметрами в неповрежденном сосуде отмечается примерно через 1,5 часа после нанесения повреждающего агента, что в 4,5 раза превышает аналогичный параметр в контрольной группе. В течение 2,5 часов не удается зарегистрировать момент полной окклюзии сонной артерии (табл.4).

В группе крыс, получивших тиклопидин, время достижения 50%-ного уровня кровотока составляет 29 мин (табл.4), что в 1,5 раза превышает аналогичный показатель в контрольной группе, но в 3,1 раза уступает по данному параметру соединения I. С этого момента снижение уровня кровотока происходит более интенсивно, и к 42 минуте после начала воздействия повреждающего фактора наблюдается полная окклюзия.

На модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током, однократное пероральное введение соединения I в дозе эквимолярной 6 мг/кг тиклопидина, приводит к достоверному увеличению времени кровотока в 2,4 раза по сравнению с контролем (табл.5). Время полной окклюзии сонной артерии в группе крыс, получивших соединение I, превышает аналогичный показатель на 85,7% по сравнению с группой крыс, которым был введен тиклопидин (р0,01).

В группе животных, получивших тиклопидин в дозе 6 мг/кг (per os, однократно), время регистрации полного артериального тромбоза превышает данный параметр в контрольной группе в среднем на 5,8 минут, что составляет 101,7% по отношению к контролю, однако различия статистически незначимы.

При изучении генерализованного коллаген-адреналинового тромбоза соединение I и тиклопидин, введенные перорально за 2 часа до моделирования генерализованного тромбоза, в разной степени уменьшали гибель животных.

При введении раствора, содержащего 0,5 мг коллагена и 0,06 мг адреналина из расчета на килограмм массы тела, в хвостовую вену животным контрольной группы, в течение 1-3 минут после введения индукторов тромбоза наблюдали гибель животных. Выживаемость в контрольной группе составила 6,3%. Соединение I достоверно уменьшало гибель мышей при моделировании системного коллаген-адреналинового тромбоза по сравнению с контролем. Выживаемость составила 55,6%. В экспериментальной группе у животных, получивших тиклопидин, выживаемость достоверно не отличалась от контрольной группы и составила 30,0%.

Таким образом, выживаемость животных в группе, получавших соединение I, в 8,9 раза превышала таковую в контрольной группе и в 1,9 раза – в группе у животных, получавших тиклопидин.

Г.Острая токсичность соединения I

Исследование острой токсичности проводили на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-22 г при внутрибрюшинном введении. Гибель животных регистрировали в течение двух недель. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У.Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – с.170-204). Величину токсикологического показателя – LD₅₀ рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона.

По результатам изучения острой токсичности показатель ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении для соединения I составил 130,0 мг/кг, таким образом, оно является умеренно токсичным.

Таблица 1
Влияние соединения I и тиклопидина на активацию тромбоцитов в бескальциевой среде, индуцированную селективным P2Y-агонистом 2-метилтио-АТФ
Вещество/группа	Концентрация log С, М	Подавление активации тромбоцитов, % (М±m)
Соединение I	-4	-70,8±6,5*
-5	-33,3±2,9*
Тиклопидин	-4	-13,3±1,3
-5	-1,2±1,6
* – данные достоверны по отношению к контролю (р0,05)

Таблица 3
Влияние соединения I и тиклопидина (в эквимолярных дозах) на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов интактных крыс (ex vivo) (M±m)
Вещество/группа	Степень агрегации, отн. ед.	Скорость агрегации, отн. ед./мин
Контроль	6,6±1,1	19,9±3,2
Соединение I	0,2±0,1*	0,2±0,1*
Тиклопидин	0,3±0,1*	0,8±0,3*
* – данные достоверны по отношению к контролю (р0,05)

Таблица 4
Влияние соединения I и тиклопидина в эквимолярных дозах (per os) на интенсивность кровотока в сонной артерии интактных крыс при моделировании артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа (III)
Вещество/группа	Время достижения 50%-ного уровня кровотока, мин	Время полного тромбоза, мин
Контроль	20	24,6±0,9
Соединение I	90	Более 150,0*#
Тиклопидин	29	42,7±1,1*
* – данные достоверны по отношению к контролю (р0,01)
# – данные достоверны по отношению к группе тиклопидина (р0,05)

Таблица 5
Влияние соединения I и тиклопидина в эквимолярных дозах (per os) на время полного прекращения кровотока в сонной артерии интактных крыс при моделировании артериального тромбоза, индуцированного электрическим током (М±m)
Вещество/группа	Время полного тромбоза, мин
Контроль	17,7±0,8
Соединение I	43,3±2,7*#
Тиклопидин	23,3±2,0*
* – данные достоверны по отношению к контролю (р0,05)
# – данные достоверны по отношению к группе тиклопидина (р0,01)

Формула изобретения

Дигидрохлорид 1-(3-морфолинопропил)-2-фенилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I: