Патент на изобретение №2167937

(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ВОДНОГО РАСТВОРА ИЛИ СУСПЕНЗИИ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ И СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ВОДНЫЙ РАСТВОР ИЛИ СУСПЕНЗИЯ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение касается способа стабилизации раствора или суспензии металлопротеазы для лучшего хранения и транспортировки такого фермента. N-блокированную аминокислоту добавляют к водному раствору или суспензии протеазы. Изобретение касается состава с металлопротеазой, стабилизированной с помощью N-блокированной аминокислоты. При добавлении N-бензилоксикарбониламинокислоты к металлопротеазе фермент стабилизирован даже в отсутствие избытка ионов Са. Соответственно обеспечивается хранение металлопротеазы в течение долгого времени, а транспортировка и хранение жидкого фермента соответственно упрощаются. Регенерация металлопротеазы улучшается в присутствии NPAA, когда указанный фермент используют в реакции связывания между N-блокированной аминокислотой и аминокислотным эфиром. Действие является наиболее заметным, когда N-бензилоксикарбониласпарагиновую кислоту используют в качестве N-бензилоксикарбониламинокислоты и фенилаланинметиловый эфир используют в качестве аминокислотного эфира в производстве аспартама. Способ по изобретению обеспечивает ингибирование деактивации металлопротеазы, а также улучшение термостабильности и стабильности при хранении фермента. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к способу стабилизации водного раствора или суспензии металлопротеазы, а также к водному раствору металлопротеазы, стабилизированному для лучшего использования, хранения и транспортировки такого фермента.

Протеазы используют в различных областях пищевой промышленности и промышленности моющих средств (поверхностно-активных веществ). Известно, что там, где протеазу используют в водном растворе или в суспензии, она теряет свою активность из-за спонтанного автолиза или денатурации (pH, температура и т. д.).

В последнее время разработан способ синтеза дипептидного заменителя сахара аспартама, использующий реакцию слияния, катализирующуюся (нейтральными) металлопротеазами такими, как “термолизин” (производимый Daiwa Chemical Co.) (K. Oyama, Bioindustry, vol. 1, N 9, pp. 5 to 11, 1985). Следовательно, протеазы, особенно металлопротеазы, должны стать важными в качестве синтетаз для пептидов в области производства. Однако эти ферменты не являются стабильными тогда, когда ферменты используют или хранят в водном растворе или в суспензии в течение длительного периода времени.

Протеазы (металлопротеазы) обычно продаются на коммерческом рынке в виде порошка. Порошкообразный фермент легко образует аэрозоли и, следовательно, существует проблема безопасности, так как это может вызвать воспаление носоглотки и глаз, если порошок прилипает к их слизистым оболочкам. Также могут возникнуть аллергические явления. В последнее время поэтому ферменты протеазы (металлопротеазы) используют в виде жидкого продукта или суспензии, имея в виду безопасность в их использовании. Однако, поскольку для стабильности самого фермента с таким жидким ферментом или суспензией нужно обращаться при низкой температуре при использовании, транспортировке и хранении, это обычно ведет к увеличению затрат (хранение при низкой температуре, более низкая активность и т.д.).

Более того, когда фермент металлопротеазу используют в реакции связывания между N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислотой (далее упоминаемой как “Z-Asp”) и L- или DL-фенилаланинметиловым эфиром (далее упоминаемым как “PM”), которая является процессом производства -L-аспартил-L-фенилаланинметилового эфира (далее упоминаемого как “Аспартам” или “APM”), аспект уменьшения концентрации активного фермента также возникает из-за адсорбции фермента на кристаллах побочного продукта N-бензилоксикарбониласпартилфенил-аланинметилового эфира (далее упоминаемого как “L-APM.PM”, например как “Z-APM.DPM”), помимо проблемы стабилизации фермента.

В случае металлопротеазы, такой как “термолизин”, выпускаемой Bacillus thermoteolyticus Rokko, хранимой или используемой в виде раствора или суспензии фермента, известно, что фермент быстро теряет активность, если не присутствуют ионы кальция в определенной концентрации. Однако в случае присутствия ионов кальция может происходить образование накипи из-за образования карбоната кальция в различных частях трубопроводов и танков, которое будет часто иметь заметное отрицательное влияние на практическое использование фермента.

Целью, которая должна быть достигнута данным изобретением, является предоставление способов использования, хранения и транспортировки металлопротеазы или подобного фермента протеазы в стабильной форме без образования накипи и предоставление таких стабилизированных составов, содержащих фермент.

Другой целью, которая должна быть достигнута данным изобретением, является предоставление способа увеличения коэффициента регенерации, который достигается путем подавления адсорбции фермента на образующихся во время реакции кристаллах (Z-APM.(D)PM).

В соответствии с изобретением присутствие или добавление N-блокированной аминокислоты (далее упоминаемой как “NPAA”) является эффективным для предотвращения деактивации ферментов металлопротеаз, особенно для заметного повышения термостабильности ферментов и их стабильности при хранении. В частности, обнаружено заметное влияние N-бензил-оксикарбонил-аминокислот (далее упоминаемых как “NZAA”). Кроме того, в соответствии с изобретением фермент металлопротеаза может быть заметно стабилизирован даже в отсутствие избытка ионов кальция с помощью присутствия или добавления NPAA. Цель данного изобретения, таким образом, достигается, если N-блокированная аминокислота присутствует или ее добавляют в водный раствор или суспензию, содержащую протеазу.

Кроме того, деактивация фермента металлопротеазы, вызванная перемешиванием, в присутствии суспензии может быть также заметно ингибирована с помощью присутствия или добавления NPAA, что является еще одной характерной чертой.

Более того, в соответствии с изобретением фермент металлопротеаза может быть заметно стабилизирован и коэффициент регенерации может быть существенно повышен с помощью присутствия NPAA, если такой фермент используют в реакции связывания между Z-Asp и PM.

В особенности, данное изобретение может быть использовано с преимуществом для хранения раствора или суспензии металлопротеазы и для обращения с ними в присутствии NPAA или для использования этого стабилизирующего эффекта при ферментативном связывании аминокислот, в частности при получении аспартама. Согласно данному изобретению стабильность при хранении ферментов металлопротеаз и коэффициент регенерации ферментов металлопротеаз могут быть заметно повышены с помощью малого количества NPAA. Соответственно, уменьшение активности этих ферментов во время хранения является крайне малым, так что не только использование или хранение такого фермента в течение длительного периода времени становится возможным, но также может быть достигнуто увеличение коэффициента регенерации ферментов металлопротеаз. Это является особенно выгодным экономически при обращении с дорогими ферментами.

Ниже данное изобретение будет объяснено подробно.

Металлопротеазы, используемые в способе по изобретению, не ограничиваются конкретно, но протеазы, подобные термолизину (нейтральные), являются наиболее поддающимися эффективному воздействию. В качестве металлопротеаз упоминаются, например, те, что производятся Bacillus proteolyticus или Bacillus stearothermophilus, или те, что производятся путем экспрессии их гена в другие организмы. Раствор или суспензия, предназначенная к использованию в данном изобретении, может быть как сырой, содержащей много примесей, так и очищенной.

NPAA, предназначенная к использованию в качестве стабилизирующей добавки, в способе данного изобретения может быть в форме соли, такой как натриевая соль, NPAA или в форме кристаллов NPAA. Если желательно, раствор или суспензия, содержащие различные виды NPAA, или смесь, содержащая различные виды NPAA, может также быть использована. В любом случае NPAA не ограничивается специально. Эффекты, вызванные NPAA не ухудшаются каким-либо образом из-за присутствия органических веществ, таких как другие аминокислоты или неорганические вещества. AA-частями в NPAA могут быть все природные L-аминокислоты, а также D-аминокислоты; кислотная группа в AA также может быть в форме эфирной группы, такой как бензиловый эфир.

В качестве N-блокирующей группы NPAA пригодными являются, например, бензилоксикарбонил (Z), третбутилоксикарбонил (BOC), формил (F), p-метоксибензилоксикарбонил (pMZ). В частности, бензилоксикарбонил-блокированные аминокислоты (ZAA) проявляют, как обнаружено, исключительно превосходный стабилизационный эффект. Процентное содержание удержанных в активной форме ферментов в присутствии NZAA может достигать 90% и выше, хотя в ее отсутствие оно составляет около 32% при хранении в условиях температуры 50^oC в течение 5 часов. В качестве NZAA рассматриваются N-бензилоксикарбонил-L-аспаргиновая кислота (упоминаемая также как Z-Asp), где аминокислотой является L-аспаргиновая кислота; N-бензилоксикарбонил-L-глютаминовая кислота (далее упоминаемая как Z-Glu), где аминокислотой является L-глютаминовая кислота; N-бензилоксикарбонил-L-фенилаланин (далее упоминаемое как Z-Phe), где аминокислотой является фенилаланин; и N-бензилоксикарбонилглицин (далее упоминаемый как Z-Gly), где аминокислотой является глицин.

В системе, где нет избытка ионов кальция, процентное содержание удержанных в активной форме ферментов составляет около 44% в отсутствие NPAA при хранении в условиях температуры 40^oC в течение 5 часов. В этой же самой системе, однако, деактивация фермента металлопротеазы заметно ингибируется с помощью добавления NPAA. В частности, когда NZAA добавляют в систему, почти не происходит инактивации протеазы. Результаты показывают, что раствор фермента металлопротеазы является крайне стабильным во время хранения или может быть использован при комнатной температуре или при температуре выше комнатной в течение длительного периода времени из-за присутствия NPAA. Таким образом, добавление NPAA является в высшей степени выгодным экономически при приготовлении и в обращении с дорогими ферментами. Согласно данному изобретению металлопротеаза является совершенно стабильной даже в отсутствие избытка ионов кальция. Следовательно, данное изобретение позволяет также избежать проблем, которые могут быть вызваны ионами кальция, например, таких как образование накипи. Здесь может быть отмечено, что в японской заявке 6226989 рассматривается стабилизация алкалинпротеаз, используемых в моющих средствах путем добавления специального количества обратимого ингибитора, такого как химостатин или Z-Phe. Авторы данного изобретения, однако, наблюдают, что добавление NPAA к другим ферментам протеазам, таким как папаин, химотрипсин или субстилизин (ни один из которых не является металлопротеазой), которые согласно литературе могут быть использованы в ферментативном APM-синтазе, не дает результатов в виде какой-либо значительной стабилизации фермента.

Более того, когда фермент металлопротеазу используют для реакции связывания между Z-Asp и PM, понижение регенерации фермента может заметно компенсировано, и очень сильно, с помощью присутствия NPAA в водном растворе или в суспензии фермента.

Молярная концентрация NPAA, предназначенная для присутствия в водном растворе или в суспензии фермента металлопротеазы для хранения и транспортировки фермента в соответствии с данным изобретением, должна превышать более чем в 30 раз концентрацию указанного фермента, предпочтительно превышать ее в 50 раз.

С другой стороны, когда фермент металлопротеаза используется в реакции связывания между Z-Asp и PM, и Z-Asp используют в качестве NPAA, молярная концентрация Z-Asp, которая должна присутствовать в водном растворе или в суспензии фермента после реакции связывания, должна превосходить более чем в 500 раз концентрацию указанного фермента и предпочтительно более чем в 1000 раз. Обычно концентрация Z-Asp должна быть больше, чем 15 ммоль/л, предпочтительно больше, чем 30 ммоль/л.

В реакции связывания между Z-Asp и PM коэффициент регенерации фермента составляет около 90%, когда концентрация Z-Asp, которая присутствует в водном растворе или в суспензии фермента после реакции связывания, составляет 50 ммоль/л (молярная концентрация в 1724 раза больше, чем концентрация фермента).

С другой стороны, коэффициент регенерации фермента составляет только 50%, если концентрация Z-Asp, которая присутствует в водном растворе или в суспензии фермента после реакции связывания, составляет 10 ммоль/л (молярная концентрация в 345 раз больше, чем концентрация фермента).

Как указано выше, металлопротеаза может быть существенно стабилизирована с помощью присутствия NPAA в водном растворе или в суспензии такого фермента, и коэффициент регенерации такого фермента также заметно увеличивается с помощью присутствия NPAA в водном растворе или в суспензии фермента, когда указанный фермент используют в реакции связывания между Z-Asp и PM.

Использование металлопротеазы в реакции связывания для производства аспартама, следовательно, является гораздо более эффективным, если молярная концентрация N-блокированной аминокислоты, такой как Z-Asp, поддерживается примерно в 500 раз больше, чем концентрация фермента, путем добавления N-блокированной аминокислоты в систему, где происходит реакция связывания во время нее или на заключительной стадии реакции связывания.

Далее, данное изобретение будет объяснено более подробно с помощью последующих примеров, которые, однако, не направлены на сужение границ изобретения.

ПРИМЕР 1
5 г порошкообразной Термоазы (сырой термолизин, торговое наименование продукта фирмы Daiwa Chemical Co.; степень очистки около 20%) суспендируют в одном литре воды, содержащем CaCl₂ 2H₂O (6.8 ммоль/л) (концентрация термоазы составляет 0.029 ммоль/л), и к этому добавляют Z-Asp до тех пор, пока определенная концентрация (2.62 ммоль/л или 24.7 ммоль/л, или, другими словами, превышающую от в 900 раз до 850 раз соответственно концентрацию фермента) не будет достигнута при pH целевого раствора, который доводят до 5.0 путем добавления водного раствора 1 н. NaOH. Для тестирования концентрации фермента, удержанного в активной форме (т.е. концентрации активного фермента), раствор фермента оставляют в колбе с отводом для отбора проб, имеющей объем 2 литра при контролируемой температуре 70^oC и при перемешивании со скоростью 240 об/мин. Через регулярные интервалы времени отбирают образцы и количество остающегося фермента в каждом образце измеряют с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Полученные результаты представлены в табл. 1.

Как отмечено в табл. 1, фермент заметно стабилизируется при добавлении Z-Asp.

ПРИМЕР 2
К 10 мл воды, содержащей 0.029 ммоль/л порошкообразной термоазы и 10 ммоль/л CaCl₂, постепенно добавляют некоторое количество NPAA до тех пор, пока определенная концентрация (10 ммоль/л) не будет достигнута, и постепенно добавляют водный раствор 1 н. NaOH, пока не установится pH 6.0. Приготовленный таким образом раствор фермента ставят на водяную баню с контролируемой температурой 70^oC. Через регулярные интервалы времени отбирают образцы и измеряют количество остающегося фермента в каждом образце с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Как отмечено в табл. 2, фермент заметно стабилизируется при добавлении NPAA, особенно, NZAA (Z-Asp, Z-Asp-OBzl, Z-Glu, Z-Phe и Z-Gly).

ПРИМЕР 3
5 г порошкообразного Thermoase растворяют в одном литре воды, содержащем CaCl₂ 2H₂O (концентрация CaCl₂ равна 0.6 ммоль/л), или воды, содержащей Z-Asp (концентрация Z-Asp равна 30 ммоль/л), каждый с концентрацией Thermoase 0.029 ммоль/л, и устанавливают pH целевых растворов 6.0 путем добавления водного раствора 1 н. NaCl. Раствор фермента оставляют в колбе с отводом для отбора пробы, имеющей объем 2 литра, с контролируемой температурой 40^oC при перемешивании со скоростью 200 об/мин.

Образцы отбирают через регулярные интервалы времени и количество оставшегося фермента в каждом образце измеряют с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Эксперименты в табл. 3 показывают, что добавление Z-Asp является таким же эффективным, как и использование раствора 0.6 ммоль/л CaCl₂; без такого избытка Ca²⁺ будет образовываться меньше накипи.

Как отмечено в табл. 3, фермент заметно стабилизируется при добавлении Z-Asp, которая является одной из NZAA, даже в отсутствие избытка ионов кальция.

ПРИМЕР 4
Некоторое количество NPAA добавляют к 100 мл водного раствора, содержащего 0.029 ммоль/л порошкообразной термоазы (не содержащего избытка Ca), до тех пор, пока не достигается определенная концентрация (10 ммоль/л), тем же способом, что и в примере 2, доводят pH системы до 6. Все это оставляют на водяной бане с контролируемой температурой 40^oC.

Из растворов ферментов через регулярные интервалы времени отбирают образцы и измеряют количество оставшегося фермента с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Как отмечено в табл. 4, фермент заметно стабилизируется при добавлении NPAA, особенно NZAA (Z-Asp, Z-Asp-OBzl, Z-Glu, Z-Phe и Z-Gly).

ПРИМЕР 5
5 г порошкообразной термоазы (степень очистки равна около 20%) суспендируют в 750 г воды, содержащей 0.1% CaCl₂ 2H₂O в колбе с отводом для отбора пробы, имеющей объем 2 литра, и добавляют к суспензии 250 г целита (производство Johns Manvill Corp. чистоты стандартного Super-Cel) до образования однородной суспензии. Контролируемую температуру поддерживают равной 40^oC, концентрацию термоазы – равной 0.029 ммоль/л.

Z-Asp добавляют к суспензии до тех пор, пока не будет достигнута определенная концентрация (30 ммоль/л), затем pH доводят до значения 7.3 с помощью 1 н. водного раствора NaOH. Суспензию перемешивают миксером, снабженным мотором при скорости вращения 240 об/мин и отбирают пробы через регулярные интервалы времени. Процентное содержание фермента, остающегося в активной форме, измеряют с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 5.

Как отмечено в табл. 5, фермент, который подвержен изменениям и деактивируется в суспензии, заметно стабилизируется при добавлении Z-Asp.

ПРИМЕР 6
5 г порошкообразной Протеазы-ТД (продукт фирмы Amano Pharmaceutical Co.; металлопротеаза, производимая Bacillus Stearothermophilus; степень очистки – около 20%) суспендируют в одном литре воды, содержащей 0.1% CaCl₂ 2H₂O, при концентрации Протеазы-ТД 0.029 ммоль/л. Z-Asp добавляют до тех пор, пока не будет достигнута определенная концентрация (10 ммоль/л), затем доводят pH до значения 5.0 с помощью 1 н. водного раствора NaOH. Полученный раствор оставляют стоять в колбе с отводом для отбора проб, имеющий объем 2 литра, поддерживая контролируемую температуру 70^oC при перемешивании со скоростью 240 об/мин. Через определенные интервалы времени отбирают образцы, и количество оставшегося фермента в каждом образце измеряют с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 6.

Как отмечено в табл. 6, фермент заметно стабилизируется при добавлении Z-Asp.

ПРИМЕР 7
943 г водного раствора Z-Asp (количество Z-Asp составляет 1.0 моль) и 1258 г водного раствора DL-PM (количество PM составляет 2.0 моль) смешивают, нагревают до 40^oC, и значение pH водного раствора устанавливают с помощью 25% раствора NaOH, и этот раствор используют в качестве раствора субстрата.

Отдельно растворяют 1.28 г CaCl₂ 2H₂O и 127 г NaCl в 1242 г очищенной воды, и 45 г термоазы растворяют в этом водном растворе, и водный раствор используют в качестве водного раствора фермента.

Раствор субстрата и водный раствор смешивают в колбе с отводом для отбора пробы объемом 5 литров, которую помещают на водяную баню, поддерживаемую при температуре 40^oC, и pH этого смешанного раствора доводят до значения 6.0, и начинается реакция связывания Z-Asp и PM.

Концентрация термоазы составляет 0.029 ммоль/л как в предыдущих примерах.

Перемешивание смешанного раствора проводят со скоростью перемешивания 130 об/мин до тех пор, пока не пройдут 3.5 часа после начала реакции связывания, и проводят перемешивание со скоростью перемешивания 30 об/мин в течение 3.5 часов, пока не пройдет всего 7 часов.

Выход Z-APM.(D)PM, основанный на начальном количестве Z-Asp, составляет 80.5% через 7 часов, и концентрация Z-Asp, которая остается после реакции связывания, составляет 55.9 ммоль/л.

Термоаза, которая регенерирует после реакции связывания, составляет 41.4 г, и коэффициент регенерации составляет около 92%.

Сравнительный пример
943 г водного раствора Z-Asp (количество Z-Asp составляет 1.0 моль) и 1572 г водного раствора DL-PM смешивают, нагревают до 40^oC, и устанавливают pH водного раствора с помощью 25% раствора NaOH, и этот раствор используют в качестве раствора субстрата.

Отдельно растворяют 1.28 г CaCl₂ 2H₂O и 127 г NaCl в 1242 г очищенной воды, и растворяют 45 г термоазы в этом водном растворе, и этот водный раствор используют в качестве водного раствора фермента.

В этом сравнительном примере большее количество PM по сравнению с примером 7 дает в результате меньшее количество Z-Asp, которое остается после связывания. Можно видеть, что это дает в результате значительно уменьшенный коэффициент регенерации термоазы.

Раствор субстрата и водный раствор смешивают в колбе с отводом для отбора проб объемом 5 литров, которую помещают на водяную баню, поддерживаемую при температуре 40^oC, и pH этого смешанного раствора доводят до значения 6.0, и начинают реакцию связывания между Z-Asp и PM.

Перемешивание смешанного раствора проводят со скоростью перемешивания 130 об/мин до тех пор, пока не пройдет 3.5 часа после начала реакции связывания, и проводят перемешивание со скоростью перемешивания 30 об/мин в течение 3.5 часов, пока не пройдет всего 7 часов.

Выход Z-APM. (D)PM, основанный на исходном количестве Z-Asp, составляет 95.2% через 7 часов, и концентрация Z-Asp, которая остается после реакции связывания, составляет 10.5 моль/л.

Термоаза, которая регенерирует после реакции связывания, составляет 19.5 г, и коэффициент регенерации составляет около 44%.

Формула изобретения

1. Способ стабилизации водного раствора или суспензии металлопротеазы, отличающийся тем, что в водный раствор или суспензию металлопротеазы вводят N-защищенную аминокислоту в молярной концентрации, превышающей более чем в 30 раз молярную концентрацию металлопротеазы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водный раствор или суспензию, содержащие металлопротеазу и N-защищенную аминокислоту, хранят или транспортируют без дополнительной обработки.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что N-защищенная аминокислота является N-бензилоксикарбониламинокислотой.

4. Способ по любому из пп.1 – 3, отличающийся тем, что металлопротеаза является термолизин-подобной, нейтральной металлопротеазой.

5. Способ по любому из пп.1 – 4, отличающийся тем, что молярная концентрация N-защищенной аминокислоты более чем в 500 раз превышает концентрацию металлопротеазы в реакции связывания N-защищенной аминокислоты и аминокислотного эфира.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанную молярную концентрацию N-защищенной аминокислоты, превышающую более чем в 500 раз концентрацию металлопротеазы, обеспечивают посредством добавления N-защищенной аминокислоты к реакционной системе во время указанной реакции связывания или на ее конечной стадии.

7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что указанная реакция связывания представляет собой реакцию связывания N-бензилоксикарбониласпарагиновой кислоты и фенилаланинметилового эфира.

8. Стабилизированный водный раствор или суспензия металлопротеазы, содержащий N-защищенную аминокислоту в молярной концентрации, превышающей более чем в 30 раз молярную концентрацию металлопротеазы.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.08.2004

Извещение опубликовано: 20.04.2006 БИ: 11/2006