Патент на изобретение №2390555
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ С ПОВЫШЕННОЙ ДЕСТРУКТИВНОЙ СПОСОБНОСТЬЮ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. В состав среды входит (г/л): солевая основа: натрий хлористый 5,0, аммоний фосфорнокислый однозамещенный 1,0, калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0, магний сернокислый 0,2, а также агар-агар 15,0, нефть 5,0 и глюкоза 1,0, дистиллированная вода – остальное. Плотная питательная среда расширяет арсенал методических подходов для выращивания микроорганизмов с повышенной способностью утилизировать углеводороды нефти, перспективных для создания на их основе биопрепаратов, предназначенных для очистки окружающей среды от нефтезагрязнения. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим характеристикам.
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной активностью с целью приготовления посевного материала для глубинного культивирования в ферментере при параметрах, оптимальных для микроорганизмов-деструкторов, получения биомассы и создания биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов. Антропогенное загрязнение окружающей среды стало серьезной проблемой и достигло глобальных масштабов. Нефть и нефтепродукты относятся к самым массовым загрязнителям природных объектов [Лисичкин В.А., Шелепин Л.А., Боев Б.В. Закат цивилизации или движение к ноосфере (Экология с разных сторон). – М.: ИЦ-ГРАНТ, 1997. – 352 с.]. В этой связи вопросы всестороннего изучения биологических свойств микроорганизмов, особенностей процессов микробной утилизации нефти и нефтепродуктов и влияния на них различных факторов, создание условий для проявления максимальной активности штаммов-деструкторов входят в число первоочередных, стоящих перед экологической биотехнологией [Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов. Автореферат дис. докт. биол. наук. – Саратов, 2000. – 43 с.].
Аналогичный подход предложен для селекции ассоциаций микроорганизмов-деструкторов токсических веществ в высококонцентрированных сточных водах [Гвоздяк П.И., Загорная И.Б., Никоненко В.У., Чеховская Т.П. А.с. СССР Известен способ селекции углеводородокисляющих бактерий в жидкой минеральной среде с добавлением нефти с последующим отбором культур для пересева через 5, 10 и 15 дней [Сатубалдин К.К., Салангинас Л.А., патент RU
Относительно механизма отрицательного действия глюкозы на углеводородокисляющие микроорганизмы известно то, что данное свойство углевода связно не с некими токсичными продуктами его метаболизма, а с регуляцией экспрессии генов, кодирующих определенные ферменты [Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток/Пер. с англ. – М.: Мир, 1978. – 332 с.]. Предполагается, что тот или иной уровень экспрессии генов определяет отрицательную обратную связь концентрации глюкозы ( Недостатком существующих питательных сред является их изначальное предназначение для выделения микроорганизмов вообще из образцов почвы и воды, контактирующих с нефтью и нефтепродуктами, либо для стимуляции аборигенной микрофлоры при ремедиации почвы, а также для активации нефтеокисляющих микроорганизмов при нефтедобыче. Такие питательные среды в принципе не могут быть использованы для выявления в популяции выделенных микроорганизмов клонов с повышенной деструктивной активностью, перспективных для использования в биотехнологических целях. В этой связи важно подобрать такой компонентный состав питательной среды, который бы обеспечил рост активных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, биомасса которых может быть использована для глубинного выращивания в ферментерах на ее основе, а также для лиофильного высушивания и получения маточных культур коллекционных линий микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. Наиболее близкой к заявляемой является питательная среда, предназначенная для выращивания микроорганизмов-продуцентов биосурфактантов, нашедших практическое использование в процессе повышения нефтеотдачи [Brown M.L., Moses V. Surfactants and their use/Патент GB
Общим с заявляемой прописью питательной среды является минеральная основа агаризованной среды и глюкоза (20,0 г/л). Стимуляция роста микроорганизмов-продуцентов биосурфактантов обеспечивается также включением в пропись питательной среды дрожжевого экстракта. Глюкоза в указанной концентрации не позволяет использовать питательную среду для скрининга высокоактивных углеводородокисляющих микроорганизмов. Выбор питательной среды оригинальной прописи Задачей изобретения является конструирование плотной питательной среды, обеспечивающей рост и размножение популяций природных и коллекционных штаммов углеводородокисляющих бактерий, обладающих повышенной деструктивной способностью. Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемой питательной среды – возможность выращивания бактерий любого вида и рода, содержащих наследуемые генетические детерминанты биодеструкции углеводородов нефти перспективных для создания на их основе биопрепаратов для очистки и рекультивации нефтезагрязненной почвы. Указанная задача решена разработкой прописи плотной питательной среды на основе необходимого и достаточного количества минеральных веществ с включением в ее состав глюкозы и нефти и специальным образом обработанной с использованием ультразвука. Разработанная плотная питательная среда успешно апробирована в процессе изучения свойств коллекционных штаммов и природных изолятов, относящихся к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Brevibacterium, Micrococcus, позволивший выявить от 20 до 50% клонов в популяции исследованных культур, вообще не способных расти на среде и утилизировать углеводороды нефти. Отобранные с использованием предлагаемой плотной питательной среды клоны способны ассимилировать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Биомасса таких клонированных микроорганизмов при росте на плотной питательной среде с нефтью в 13-14 раз выше по сравнению с биомассой исходной популяции углеводородокисляющих бактерий. Плотная питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью содержит солевую основу: натрий хлористый, аммоний фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и магний сернокислый, а также агар-агар, нефть и глюкозу, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Приготовление плотной питательной среды для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью осуществляют следующим образом. Навеску солей растворяют в дистиллированной воде и устанавливают рН 7,5. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием (температура 121±1°С, давление пара 1,2-1,5 атм) в течение 15 мин. Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 1,0 г глюкозы, предварительно растворенной в 5,0 мл дистиллированной воды и стерилизованной фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0,2 мкм), 5,0 г сырой нефти и в горячем виде подвергают обработке ультразвуковом на ультразвуковом низкочастотном диспергаторе при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин. Полученную суспензию, содержащую эмульгированную нефть, разливают в стандартные чашки Петри. После охлаждения питательная среда с нефтью и глюкозой готова к использованию. Обработка разогретой в процессе автоклавирования питательной среды после внесения глюкозы и нефти ультразвуком позволяет получить гомогенную, нерасслаивающуюся эмульсию агаризованной среды с нефтью, которая после охлаждения обеспечивает рост нефтеокисляющих микроорганизмов и позволяет характеризовать колонии по морфологическим признакам. Положительной характеристикой заявляемой питательной среды является наличие в ее составе глюкозы. Учитывая регуляторное влияние глюкозы на активность углеводородокисляющих бактерий, содержащая ее плотная питательная среда с нефтью позволяет существенно расширить возможности получения биомассы микроорганизмов-деструкторов нефтезагрязнений, обладающих повышенной активностью. Глюкоза не оказывает отрицательного влияния на качество плотной питательной среды по физико-химическим и биологическим свойствам. Разработанная питательная среда с успехом использована для выращивания углеводородокисляющих бактерий различных таксономических групп для последующего их лиофильного высушивания и в качестве посевного материала для глубинного культивирования в ферментерах и создания биопрепаратов на их основе. Пример 1 Готовят навеску солевой основы при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Навеску солей растворяют в 975,0 мл дистиллированной воды в колбе и устанавливают рН 7,5. Добавляют в колбу 15,0 г агар-агара, выдерживают 30 мин при комнатной температуре для его набухания. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин. Готовят стерильный раствор глюкозы, растворяя 1,0 г углевода в 5,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0, 2 мкм). Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 5,0 мл стерильного раствора глюкозы и 5,0 г сырой нефти, подвергают обработке ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают в чашки Петри и оставляют на 1 ч для остывания питательной среды. На затвердевшую поверхность питательной среды с нефтью в чашках Петри наносят методом отпечатков предварительно выращенные на агаре Хоттингера колонии бактерий Alcaligenes xylosoxidans ssp.xylosoxidans. Чашки Петри с посевами бактерий на питательную среду с нефтью инкубируют при температуре 37±1°С. Через 24 ч инкубации исследуют популяционный состав бактерий A. xylosoxidans ssp.xylosoxidans по способности расти на питательной среде с нефтью и, соответственно, утилизировать углеводороды нефти с последующим отбором искомых колоний бактерий с повышенной деструктивной способностью. Пример 2 Готовят навеску солевой основы при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Навеску солей растворяют в 975,0 мл дистиллированной воды в колбе и устанавливают рН 7,5. Добавляют в колбу 15,0 г агар-агара, выдерживают 30 мин при комнатной температуре для его набухания. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин. Готовят стерильный раствор глюкозы, растворяя 1,0 г углевода в 5,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0, 2 мкм). Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 5,0 мл стерильного раствора глюкозы и 5,0 г сырой нефти, подвергают обработке ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают в чашки Петри и оставляют на 1 ч для остывания питательной среды. На затвердевшую поверхность питательной среды с нефтью в чашках Петри наносят методом отпечатков предварительно выращенные на агаре Хоттингера колонии бактерий Rhodococcus erythropolis. Чашки Петри с посевами бактерий на питательную среду с нефтью инкубируют при температуре 28±1°С. Через 48 ч инкубации исследуют популяционный состав бактерий R. erythropolis по способности расти на питательной среде с нефтью и, соответственно, утилизировать углеводороды нефти с последующим отбором искомых колоний бактерий с повышенной деструктивной способностью.
Формула изобретения
Питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью, содержащая солевую основу: натрий хлористый, аммоний фосфорно-кислый однозамещенный, калий фосфорно-кислый двузамещенный и магний серно-кислый, а также агар-агар, нефть и глюкозу, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
рН 7,2-7,4 ед. рН |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
