Патент на изобретение №2390349
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ЭКСТРАКТ SOPHORAE SUBPROSTRATAE RADIX ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству для лечения респираторных заболеваний. Фармацевтическое средство для лечения респираторных заболеваний, содержащее в качестве активного ингредиента водный или спиртовый экстракт Sophorae Subprostratae Radix или экстракт Sophorae Subprostratae Radix в неполярном растворителе. Вышеописанное средство эффективно для лечения респираторных заболеваний. 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 табл.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Изобретение относится к экстракту Sophorae Subprostratae Radix, полезному для предупреждения и лечения респираторных заболеваний. Данное изобретение также относится к фармацевтическому лекарству, содержащему экстракт Sophorae Subprostratae Radix, полезный для предупреждения и лечения респираторных заболеваний благодаря своим исключительным эффектам в предупреждении контракции дыхательных путей, респираторной инфекции, исключительным эффектам на 5-липоксигеназу, фосфодиэстеразу 4, гиперреактивность дыхательных путей или ремоделирование дыхательных путей, лейкотриен D4, а также благодаря тому, что он имеет противокашлевый эффект. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Астма представляет собой типичное респираторное заболевание, характеризующееся повторяющимися и спазматическими симптомами затруднения дыхания, кашля и стридора. Приблизительно у 30% детей-астматиков эти симптомы начинают проявляться в течение первого года жизни, тогда как приблизительно у 80% астматиков симптомы проявляются в возрасте 4-5 лет. В Корее частота появления астмы составляет 10%. Рост заболеваемости астмой в некоторой степени меняется в зависимости от страны, расы, возраста и тому подобному. Согласно отчету Великобритании за 1991 г. от астмы страдает приблизительно 7% взрослого населения и 13,5% детей. В Корее число астматиков увеличивается из-за резкого изменения образа жизни, а также условий окружающей среды, такого как сильное загрязнение и накапливающийся стресс. Возраст проявления астмы в последнее время уменьшился из-за ухудшения окружающей среды, такого как загрязнение, и ее симптомы стали иметь пролонгированный характер. Обструкция дыхательных путей как одна из характеристик астмы проходит через 3 этапа, а именно: сокращение (контракция) гладкой мускулатуры бронхов, тилоз слизистой оболочки легкого и накопление вязкой слизи в бронхах и бронхиолах. Из них сокращение гладкой мускулатуры бронхов довольно легко излечивается. Известно, что в приступах экзогенной (аллергической) астмы очень важную роль играет IgE и также часто участвует IgG. IgE высвобождает медиаторы (гистамин, SRS-А (медленно реагирующую субстанцию анафилаксии), ECF-A (фактор хемотаксиса эозинофилов при анафилаксии), NCF (фактор хемотаксиса нейтрофилов), PAF (фактор активации тромбоцитов), кинин, PGs (простагландины) и так далее), которые индуцируют реакцию гиперчувствительности, путем активации тучных клеток. Причина эндогенной (неаллергической) астмы до сих пор не известна, но этот вид астмы, по-видимому, опосредован вегетативными нервами. У пациента с эндогенной астмой холинергический стимул может сразу высвобождать медиаторы, такие как гистамин, из тучных клеток, увеличивать секрецию бокаловидных клеток, расширять кровеносные сосуды легкого и вызывать сокращение трахеи, бронхов и больших бронхиол, вызывая тем самым бронхоспазм и усиление секреции слизи. До сих пор астма является неизлечимой. Хотя существует много методик и лекарств, которые уже используют для предупреждения спазма и осложнений, обусловленных астмой, они не являются достаточными. Один из наиболее эффективных путей предупреждения приступа астмы может состоять в том, чтобы найти истинные факторы, которые вовлечены в механизм, вызывающий астму. Примерами терапевтических агентов, которые уже используют в лечении астмы, являются ингаляционные бронхолитические лекарства, пероральные или инъекционные бронхолитические лекарства (симпатические стимуляторы и теофиллины), стероидные препараты (в ингаляционной, пероральной и инъекционной форме, и так далее), лейкотриеновые антагонисты (монтелукаст, пранлукаст, зилейтон и так далее), противоаллергические лекарства (динатрий-кромолин, кетотифен и так далее) и тому подобное. Бронхит может быть либо острым, либо хроническим. В соответствии с причинами, вызывающими бронхит, различают аллергический, инфекционный и экзогенный бронхит, в то время как в соответствии с патологий его классифицируют как катаральный, гнойный, окклюзионный, язвенный и инфильтративный бронхит. Наиболее частой причиной бронхита является инфекция бактериями, вирусами, грибками и тому подобным. Люди, в норме не инфицированные вышеуказанными патогенами, могут быть инфицированы, когда их система общего иммунитета становится ослабленной. Аллергический бронхит может являться прямой аллергической реакцией на ингаляцию аллергенов или частным симптомом, обусловленным генерализованной аллергической реакцией. Экзогенный бронхит может быть вызван химическим стимулом, таким как газообразный хлор и сернистый газ, или физическим стимулом, таким как пыль. Люди, живущие в больших городах с загрязненным воздухом, могут часто подвергаться респираторным инфекциям. С точки зрения патологии, в случае острого бронхита легко обнаруживаются покраснение, опухоль и ксероз, а также слизистые и гнойные выделения. Обычно астму можно вылечить без возникновения осложнений. Однако, если она развивается в хроническую астму, это приводит к опухоли, тилозу и атрофии. Пролонгированная хроническая астма приводит к пролиферации волокна, бронхостенозу или легочной эмфиземе. Наиболее специфическими симптомами бронхита являются кашель и мокрота. Если причиной бронхита является инфекция, то часто развивается лихорадка и боль в груди, тогда как если бронхит обусловлен экзогенными факторами, часто развивается раздражение слизистой оболочки рта, носа, глаз и так далее. В лечении кашель считают видом защиты организма, и поэтому не рекомендуется намеренно останавливать кашель. По этой причине существенно, чтобы лечение сопровождалось другими мерами. Зимой желательно повысить комнатную температуру и ввести небольшое количество кодеина, атропина, эфедрина, антигистаминных агентов и тому подобного. Использование стероидов или теофиллинов для лечения инфекций не является удовлетворительным. Назальное аллергическое воспаление часто относится к назальной аллергии или аллергическому риниту. Оно вызывает симптомы внезапного продолжительного кашля, выделения большого количества прозрачной носовой слизи, заложенного носа, тяжелой головы, выделения слез и тому подобное. Когда имеют место подобные симптомы, но аллергены не идентифицированы, это – вазомоторный ринит. Например, вышеупомянутые симптомы могут иметь место, когда утром временно понижена температура тела, и они обычно проходят в течение нескольких часов, и данные симптомы обычно наблюдаются у людей в холодное время года. Иногда их можно спутать с насморком, но эти симптомы отличаются от простуды и часто сопровождают астму и крапивницу. Аллергическая реакция при аллергическом рините представляет собой гиперчувствительную реакцию антиген-антитело, когда из тучных клеток и клеточных стенок базофилов высвобождается гистамин, и высвобождается арахидоновая кислота, из которой образуются простагландины и лейкотриены с помощью циклооксигеназы (СОХ) и 5-липоксигеназы (5-LO), данные процессы опосредуют раннюю реакцию, происходящую в течение 2-90 минут после воздействия антигена, и реакцию поздней фазы, имеющую место через 4-8 часов после этого. Ранняя реакция продолжается в результате действия медиатора, тогда как реакция поздней фазы опосредована клеточной инфильтрацией. Дополнительно, как аллергический, так и неаллергический ринит являются факторами риска для развития астмы. Десенсибилизацию при лечении выполняют тогда, когда антиген точно идентифицирован. Имеются другие методики лечения, такие как использование лекарств, хирургические вмешательства, физиотерапии, но они не считаются лечением, приводящим к полному выздоровлению. Существуют различные респираторные инфекции, вызываемые, например, пиогенными бактериями, определенными бактериями (Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae, спирохетой и так далее), вирусами, грибками, и их также делят на острые и хронические респираторные инфекции. Когда полость носа, глотка и гортань инфицированы независимо, данные заболевания классифицируют по названиям соответствующих органов. Однако, когда вышеупомянутые органы инфицированы как одно целое, заболевания классифицируют как инфекции верхних дыхательных путей, и наглядным примером является заболевание верхних дыхательных путей. Кроме того, в случае инфекций, вызываемых определенными бактериями или грибками, их также часто классифицируются как туберкулез верхних дыхательных путей, дифтерия верхних дыхательных путей, кандидоз верхних дыхательных путей и тому подобное. Как указано выше, респираторные заболевания, такие как астма, аллергический ринит, острый и хронический бронхит, отличаются вызывающими их причинами и своими симптомами, но в следующих нескольких аспектах они имеют общие характеристики. Во-первых, все они являются воспалительными заболеваниями. Данные респираторные заболевания вызываются аллергиями, инфекциями и так далее, но воспаление играет критическую роль в обострении и лечении этих заболеваний. То есть, введение лейкоцитов в дыхательные пути, стимулированное аллергиями, инфекциями и так далее, и их активация в данном месте, и различные цитокины, высвобождаемые из лейкоцитов, и медиаторы воспаления обостряют заболевания и оказывают влияние на терапевтическое лечение. Во-вторых, контракция и релаксация дыхательных путей не выполняется нормально, что приводит к затруднению дыхания. То есть, дыхательные пути нарушены, в результате чего они дают избыточную реакцию (в случае астмы) в ответ на обычный стимул, или они слишком сужаются для выполнения бронхиального дыхания, что требует соответствующего лечения. В-третьих, в основных лекарственных терапиях важную роль играют противовоспалительные агенты, агенты, которые ингибируют контракцию дыхательных путей, бронходилататоры, агенты, которые ингибируют секрецию дыхательных путей, а также, обычно в комбинации, используют другие терапевтические лекарства. Например, обычно используют антигистаминные лекарства, антихолинергические лекарства, агонист бета 2-рецепторов, стероиды, антагонисты рецепторов лейкотриена D4, ингибиторы фосфодиэстеразы 4 теофиллины. Однако бронхолитические лекарства, такие как антихолинергические лекарства, агонист бета 2-рецепторов и так далее, не являются эффективными в лечении воспаления, а просто смягчают данные симптомы. Поэтому длительное использование этих лекарств может вызывать резистентность к лекарству, и также существует риск обострения. Стероиды, как известно, являются эффективными в лечении воспаления, но они вызывают серьезные побочные эффекты и не подходят для длительного использования, и также показано, что они не являются эффективными в лечении хронического бронхита. Поэтому назначают комбинированное введение двух вышеупомянутых лекарства, но стероидное лекарство из-за его неблагоприятных эффектов готовят в виде препарата в ингаляционной форме, а не в виде препарата для перорального введения, что понижает его соответствие режиму приема из-за трудности во введении. Поэтому существует необходимость в разработке нового терапевтического лекарства, которое может устранить вышеупомянутые ограничения терапевтических лекарств, используемых в настоящее время, и эффективно улучшить симптомы. Однако, как указано выше, в респираторных заболеваниях участвуют различные лейкоциты и различные цитокины и медиаторы воспаления, трудно лечить респираторные заболевания одним химическим ингредиентом, и поэтому природный экстракт, содержащий различные активные ингредиенты с различными механизмами действия, может оказаться способным служить эффективным терапевтическим лекарством. Дополнительно, существует, по-видимому, много причин, вызывающих респираторные заболевания, такие как астма, бронхит, аллергический ринит, острые инфекции нижних дыхательных путей (бронхит, бронхиолит и так далее), острые инфекции верхних дыхательных путей (тонзиллит, фаринголарингит), но их лечение приносит только временное облегчение, и обычно существует проблема рецидива данных заболеваний после лечения. Поэтому одной из наиболее важных стоящих перед медицинской наукой задач, которую нужно решить, является предупреждение и лечение респираторных заболеваний и крайне необходимой является разработка нового терапевтического лекарства для кардинального предупреждения и лечения респираторных заболеваний. Sophorae Subprostratae Radix, который по настоящему изобретению может быть использован в качестве лекарственного сырья, представляет собой кустарник высотой 1-2 м. Он имеет приблизительно 2-5 цилиндрических корней желтовато-коричневого цвета. Его ствол имеет цилиндрическую форму, имеет бороздки на поверхности и густо покрыт короткими и мягкими ворсинками, верхняя часть ствола обычно изогнута в форме КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Авторы настоящего изобретения провели всесторонние исследования с целью разработки терапевтического лекарства, эффективного в лечении респираторных заболеваний, и в результате обнаружили, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix обладает исключительной активностью ингибирования контракции дыхательных путей, респираторных инфекций, 5-липоксигеназы, фосфодиэстеразы 4, гиперчувствительности дыхательных путей и ремоделирования дыхательных путей; антагонистической активностью в отношении лейкотриена D4 и противокашлевым эффектом. Поэтому предмет настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить терапевтическое лекарство для предупреждения и лечения респираторных заболеваний, содержащее экстракт Sophorae Subprostratae Radix в качестве активного ингредиента. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Вышеупомянутые аспекты и другие признаки настоящего изобретения будут раскрыты в нижеследующем описании, сопровождаемом графическими материалами, где: Фиг.1 представляет собой график, показывающий эффект [SAL: физиологического раствора, OVA: яичного альбумина, SOS: экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2] на гиперчувствительность дыхательных путей. Фиг.2 A-F представляют собой снимки, показывающие эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию слизи в дыхательных путях легочных тканей OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Фиг.3 представляет собой гистограмму, показывающую эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию слизи в дыхательных путях легочных тканей OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Фиг.4 A-F представляют собой снимки, показывающие эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию Фиг.5 представляет собой гистограмму, показывающую эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию Фиг.6 A-F представляют собой снимки, показывающие эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на перибронхиальный фиброз в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Фиг.7 представляет собой гистограмму, показывающую эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на фиброз в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Фиг.8 представляет собой гистограмму, показывающую эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на общее содержание коллагена в легких OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Фиг.9 представляет собой результат вестерн-блоттинга, показывающий эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию белков IL-4 (интерлейкина 4), IL-5 и IL-13 в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ В одном аспекте настоящее изобретение относится к экстракту Sophorae Subprostratae Radix, полезному для предупреждения и лечения респираторных заболеваний. В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическому лекарству, содержащему в качестве активного ингредиента экстракт Sophorae Subprostratae Radix, который обладает исключительными эффектами ингибирования контракции дыхательных путей, респираторных инфекций, активности 5-липоксигеназы, активности фосфодиэстеразы 4, гиперчувствительности дыхательных путей и ингибирующей активностью в отношении ремоделирования дыхательных путей; антагонистической активностью в отношении лейкотриена D4; противокашлевым эффектом; и поэтому являющемуся полезным для предупреждения и лечения респираторных заболеваний, таких как астма, острый и хронический бронхит, аллергический ринит, острая инфекция нижних дыхательных путей (бронхит, бронхиолит и так далее), острая инфекция верхних дыхательных путей (сфагит, тонзилит, ларингит) и тому подобное. Далее описаны дополнительные детали настоящее изобретения. Способ приготовления экстракта Sophorae Subprostratae Radix согласно настоящему изобретению заключается в следующем. 1) Неочищенный Sophorae Subprostratae Radix экстрагируют при дефлегмации с использованием приблизительно от 7- до 10-кратного (относительно массы Sophorae Subprostratae Radix) количества воды или спиртового раствора, и затем фильтруют. Остаток экстрагируют снова путем добавления приблизительно от 4- до 7-кратного (относительно массы объединенного Sophorae Subprostratae Radix) количества воды или спиртового раствора с последующим нагреванием, и затем фильтруют. Полученные таким образом два фильтрата объединяют вместе и фильтруют. 2) Фильтрат, полученный на вышеупомянутой стадии 1), сепарируют путем разделения фаз, используя равное количество водонасыщенного низшего спирта или неполярного растворителя, и затем концентрируют при пониженном давлении при 50-60°C. 3) Вышеупомянутый концентрат подвергают азеотропному концентрированию путем добавления приблизительно от 20- до 50-кратного количества воды (относительно общей массы концентрата, полученного на вышеупомянутой стадии 2), суспендируют до однородного состояния с равным количеством воды и затем лиофилизуют. Более конкретно, к исходному неочищенному Sophorae Subprostratae Radix добавляют воду или спиртовой раствор и экстрагируют при дефлегмации в течение 2-5 часов, при этом предпочтительно, чтобы количество воды или спиртового раствора превышало массу неочищенного Sophorae Subprostratae Radix приблизительно в 7-10 раз. Затем вышеупомянутый экстракт фильтруют. Затем к данному фильтрату добавляют приблизительно от 4- до 7-кратного (относительно массы неочищенного Sophorae Subprostratae Radix) количества воды или спиртового раствора, нагревают, повторно экстрагируют в течение 2-5 часов, фильтруют и объединяют с ранее полученным фильтратом, повышая таким образом эффективность экстракции. При этом если количество воды будет слишком мало, нельзя будет обеспечить эффективное перемешивание, а также может снизиться растворимость полученного экстракта, что, соответственно, уменьшит эффективность экстракции, тогда как если количество воды будет избыточным, придется увеличить количество низшего спирта и неполярного растворителя, которое должно быть использовано на следующей стадии очистки, что, соответственно, будет неэкономичным, а также возникнет проблема с обработкой. Согласно настоящему изобретению экстракция состоит из первой экстракции и второй экстракции. Когда получают большой объем неочищенного экстракта, он обычно содержит большое количество воды, что обусловлено самим неочищенным лекарством, несмотря на то что фильтрация выполнена эффективно. Поэтому настоящее изобретение предотвращает относительно низкую эффективность экстракции, достигаемой в результате только одной первой экстракции. Кроме того, дополнительное исследование эффективности экстракции, выполненное авторами настоящего изобретения, показало, что приблизительно 80-90% всего экстракта получается в результате второй экстракции, что дает возможность предположить, что дополнительные экстракции (выполнение более двух экстракций) являются ненужными, а также неэкономичными. Экстракт, полученный в результате первой и второй экстракций, указанных выше, фильтруют, концентрируют и затем очищают, чтобы избавиться от ненужных примесей, таких как белки, полисахариды, жирные кислоты и тому подобное. Согласно настоящему изобретению к данному фильтрату добавляют равное количество низшего спирта или неполярного растворителя и выполняют 2-4 раза разделение фаз, получая таким образом фракцию растворителя и отделяя примеси. При этом примеры низших спиртов включают спирт, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно бутиловый спирт, пропиловый спирт или изопропиловый спирт. Примерами неполярных растворителей являются этилацетат, дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод или метилэтилкетон. Когда количество низшего спирта или неполярного растворителя меньше количества фильтрата, это часто приводит к образованию гранул из-за присутствия примесей, таких как жирные кислоты, и, соответственно, не может быть эффективно выполнено разделение фаз, и эффективность экстракции активных ингредиентов также становится относительно низкой и, соответственно, неэффективной. Фракцию низшего спирта или неполярного растворителя, полученную в результате вышеупомянутого разделения фаз, концентрируют при пониженном давлении при 50-60°С с удалением остающегося в пробе растворителя. Полученный таким образом концентрат подвергают азеотропной концентрации 2-3 раза приблизительно с 25-50-кратным (относительно общей массы концентрата) количеством воды и затем суспендируют до однородного состояния путем добавления равного количества воды. Основная причина выполнения азеотропной концентрации заключается в том, чтобы эффективно контролировать содержание остающегося низшего спирта, что необходимо для использования экстракта неочищенного лекарства в качестве сырья для фармацевтического лекарства. Дополнительно экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению может быть получен, наряду с вышеупомянутым способом, путем экстракции водой, водонасыщенным низшим спиртом или неполярным растворителем с последующей очисткой. Примеры низших спиртов включают спирт, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно бутиловый спирт, пропиловый спирт или изопропиловый спирт. Примерами неполярных растворителей являются этилацетат, дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод или метилэтилкетон. Полученный таким образом экстракт Sophorae Subprostratae Radix подвергают лиофилизации, и затем конечный экстракт получают в форме порошка. Данный конечный экстракт обладает исключительной активностью ингибирования контракции дыхательных путей, воспаления дыхательных путей, активности 5-липоксигеназы, активности фосфодиэстеразы 4, гиперчувствительности дыхательных путей и ремоделирования дыхательных путей; антагонистической активностью в отношении лейкотриена D4, противокашлевым эффектом и так далее, и, соответственно, ожидается, что он будет являться полезным для предупреждения и лечения респираторных заболеваний. Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению при клинических исследованиях можно вводить в различных пероральных и парентеральных формах. Когда их готовят в виде препарата, используют разбавители, такие как наполнитель, агент, придающий объем, связующее вещество, увлажняющий агент, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и тому подобное, или эксципиент. Твердые препараты для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы, пастилки, суппозитории и тому подобное. Данные твердые препараты готовят путем добавления к смеси лигнина и соединения лактона или его производного по меньшей мере одного эксципиента, выбранного из группы, состоящей из крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатина и тому подобного. Кроме того, дополнительно к основному эксципиенту, может быть использовано смазывающее вещество, такое как стеарат магния, тальк и тому подобное. Основами для суппозиториев являются твердые триглицериды, полиэтиленгликоль, полисорбат, какао-масло, лауриновое масло, глицерин, желатин и тому подобное. Жидкие препараты для перорального введения представляют собой суспензии, растворы (сиропы, напитки и так далее), эмульсию и тому подобное. Дополнительно к наиболее часто используемым разбавителям, таким как вода и вазелиновое масло, могут быть использованы, например, различные эксципиенты, такие как увлажняющие агенты, подсластители, корригенты и консерванты. Препараты для парентерального введения представляют собой стерильные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизаты. Растворителями для неводных растворов, суспензий или эмульсий являются растительные масла, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, оливковое масло и этилолеат. Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению использовался в народных средствах в течение долгого времени, и его безопасность подтверждена путем испытания на токсичность. Доза экстракта Sophorae Subprostratae Radix зависит от различных факторов, таких как скорость всасывания в организме, масса тела, возраст, пол, состояние здоровья, питание субъекта и время, требуемое для введения, способ введения, скорость экскреции, серьезность заболеваний и тому подобное. Как показано в фармакологических экспериментах, экстракт Sophorae Subprostratae Radix предпочтительно вводить в количестве приблизительно 1-15 мг/кг массы тела. Поэтому экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению, предназначенный для применения в качестве активного ингредиента фармацевтического лекарства, следует изготавливать, принимая во внимание эффективный диапазон фармацевтической эффективности, и, соответственно, фармацевтические препараты, изготовленные в стандартной лекарственной форме, можно вводить через регулярные интервалы и/или в соответствии с предназначенным для конкретной цели лечением, совершаемым под наблюдением врача-специалиста или по требованию субъекта. Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на нижеследующие примеры, однако их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Подготовительный пример 1: Приготовление экстракта Sophorae Subprostratae Radix 250 г Sophorae Subprostratae Radix, измельченного до размера приблизительно 1,0 см, хорошо перемешивали, добавляли 2 л воды и затем экстрагировали при нагревании в течение 5 часов с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали, и к остатку добавляли 1,5 л воды, и экстрагировали при нагревании в течение 3 часов. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали до конечного объема 1,5 л. К указанному концентрату добавляли равный объем водонасыщенного н-бутилового спирта и 3 раза проводили разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, добавляли 0,1 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae Subprostratae Radix в виде порошка. Подготовительный пример 2: Приготовление экстракта Sophorae Subprostratae Radix Sophorae Subprostratae Radix очищали от загрязнений водой и сушили. К 250 г Sophorae Subprostratae Radix добавляли 2 л 50% (об./об.) pacтвора этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 6 часов с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали, и к остатку добавляли 1,5 л 30% (об./об.) раствора этанола, и экстрагировали при нагревании в течение 3 часов. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали до конечного объема 1,5 л. К указанному концентрату добавляли равный объем водонасыщенного н-бутилового спирта и 3 раза проводили разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae Subprostratae Radix в виде порошка. Подготовительный пример 3: Приготовление экстракта Sophorae Subprostratae Radix Sophorae Subprostratae Radix очищали от загрязнений водой и сушили. К 250 г Sophorae Subprostratae Radix добавляли 2 л водонасыщенного раствора бутилового спирта и экстрагировали при дефлегмации в течение 6 часов с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали, и к остатку добавляли 1,5 л водонасыщенного раствора бутилового спирта, и экстрагировали при нагревании в течение 3 часов. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae Subprostratae Radix в виде порошка. Подготовительный пример 4: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2,5 л этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 5 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в воде и затем к нему добавляли равный объем водонасыщенного н-бутилового спирта и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae subprostrata Radix в виде порошка. Подготовительный пример 5: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л метанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л метанола и экстрагировали при нагревании в течении 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в воде и затем к нему добавляли равный объем водонасыщенного н-бутилового спирта и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, к нему добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae subprostrata Radix в виде порошка. Подготовительный пример 6: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л н-пропанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л н-пропанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в воде и затем к нему добавляли равный объем водонасыщенного н-бутилового спирта и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, к нему добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae subprostrata Radix в виде порошка. Подготовительный пример 7: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л 2-пропанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л 2-пропанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в воде и затем к нему добавляли равный объем водонасыщенного н-бутилового спирта и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, к нему добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae subprostrata Radix в виде порошка. Подготовительный пример 8: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме этилацетата и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только этилацетатную фракцию и концентрировали при пониженном давлении при 45°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 9: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме хлороформа и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию хлороформа и концентрировали при пониженном давлении при 45°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 10: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме дихлорметана и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только дихлорметановую фракцию и концентрировали при пониженном давлении при 45°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 11: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме четыреххлористого углерода и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию четыреххлористого углерода и концентрировали при пониженном давлении при 45°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 12: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л 50% (по объему) раствора этанола и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме метилэтилкетона и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию метилэтилкетона и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 13: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л ацетона и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л ацетона и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме водонасыщенного н-бутилового спирта и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только фракцию н-бутилового спирта и концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. После того как большую часть н-бутилового спирта и воды выпаривали, к нему добавляли 0,2 л воды и азеотропно концентрировали 3 раза. Полученный концентрат ресуспендировали в равном объеме дистиллированной воды и затем лиофилизировали с получением конечного экстракта Sophorae subprostrata Radix в виде порошка. Подготовительный пример 14: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л ацетона и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л ацетона и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали. Этот концентрат суспендировали в очищенной воде и равном объеме этилацетата и дважды осуществляли разделение фаз. Собирали только этилацетатную фракцию и концентрировали при пониженном давлении при 45°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 15: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л этилацетата и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л этилацетата и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали при пониженном давлении при 45°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Подготовительный пример 16: Приготовление экстракта Sophorae subprostrata Radix Sophorae subprostrata Radix очищали водой и сушили. К 250 г Sophorae subprostrata Radix добавляли 2 л метилэтилкетона и экстрагировали при дефлегмации в течение 4 ч с перемешиванием. Полученный фильтрат собирали и к остатку добавляли 2 л метилэтилкетона и экстрагировали при нагревании в течение 4 ч. Два указанных фильтрата объединяли и затем концентрировали при пониженном давлении при 58°С до тех пор, пока экстракт не становился сухим. Пример 1: Эксперимент по ингибированию контракции дыхательных путей (in vitro) Чтобы оценить ингибирующий эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix, приготовленного в Подготовительных Примерах 1-3, на контракцию дыхательных путей, проводили эксперимент с использованием ампутированных бронхов, таким образом, как описано ниже; данные приведены в Таблице 1. [Методика] Самца морской свинки линии Hartely (400-450 г, SLC, Япония) сенсибилизировали путем внутривенной инъекции 1,5 мл/кг антисыворотки против яичного альбумина. Через 48 часов после данной сенсибилизации морскую свинку умерщвляли путем обескровливания, и затем изолировали ее трахеи. Другие ткани, соединенные с бронхами, удаляли в растворе Krebs-Heseleit, и из этих бронхов вырезали кольцо таким образом, чтобы оно содержало 2-3 хряща. Поддерживая бронхиальные мышцы интактными, вырезали хрящевые части данного кольца, и с обеих сторон прикрепляли нить, и подвешивали в ванну для органов. Чтобы индуцировать максимальную контракцию, после стабилизации добавляли 10 мкг/мл карбохолина. Бронхи промывали раствором Krebs-Heseleit и стабилизировали. Добавляли индометацин (2 микромоля), и через одну минуту после этого в ванну для органов добавляли тестируемое вещество “X”. Чтобы индуцировать контракцию, через 5 минут добавляли 10 мкг/мл яичного альбумина (OVA). Степень контракции дыхательных путей вычисляли путем сравнения контракций, индуцированных карбохолином и OVA. Отношение контракции/релаксации дыхательных путей измеряли с использованием прибора для измерения физиологической активности (МР150, BioPAC system), соединенного с динамометрическим датчиком (FT4, BioPAC system).
Данные таблицы 1 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix no настоящему изобретению обладает эффектом ингибирования контракции дыхательных путей. Пример 2: Эксперимент по ингибированию контракции дыхательных путей (in vivo) Чтобы оценить ингибирующий эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix, приготовленного в Подготовительных Примерах 1-3, на контракцию дыхательных путей, эксперименты проводили таким образом, как описано ниже, подвергая сенсибилизированную морскую свинку воздействию антигенов; данные приведены в Таблице 2. [Методика] Самца морской свинки линии Hartely (400-450 г, SLC, Japan) сенсибилизировали путем внутривенной инъекции 1,5 мл/кг антисыворотки против яичного альбумина. Через 48 часов после данной сенсибилизации морской свинке перорально вводили лекарство. Через 30 минут морскую свинку предварительно обрабатывали путем подкожной инъекции 10 мг/кг пириламинмалеата, 10 мг/кг индометацина и 0,1 мг/кг пропранолола, соответственно. Затем морскую свинку помещали в бокс двухкамерного плетизмографа (HSE, Германия) с установленным плетизмометром для измерения различных показателей дыхания, и измеряли основные показатели сопротивления дыханию. Через 30 минут после предварительной обработки в течение 2 минут распыляли 1% OVA в аэрозольной форме с использованием сжатого под высоким давлением воздуха. Сопротивление дыханию, как показатель бронхоспазма, измеряли в течение 30 минут.
Данные таблицы 2 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix no настоящему изобретению обладает эффектом ингибирования контракции дыхательных путей в сенсибилизированной морской свинке. Пример 3: Эксперимент по ингибированию воспаления дыхательных путей Чтобы оценить ингибирующий эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix, приготовленного в Подготовительных Примерах 1-3, на бронхиальное воспаление, эксперименты проводили таким образом, как описано ниже, используя повышение количества лейкоцитов, таких как эозинофилы, на площади легочных бронхов в результате воздействия антигенов на сенсибилизированную мышь; данные приведены в Таблице 3. [Методика] Самку мыши линии BALB/c в возрасте 6 недель (SLC, Япония) сенсибилизировали путем интраперитонеального введения 0,2 мл смеси, состоящей из 10 мкг OVA и алюминиевых квасцов, в 0-й, 7-й и 14-й дни, соответственно. Чтобы индуцировать воспаление дыхательных путей, на 8-й и 10-й дни после последней сенсибилизации в течение 50 минут на мышь распыляли 0,7% OVA в аэрозольной форме с использованием сжатого под высоким давлением воздуха. Через 24 часа после индукции воспаления дыхательных путей, бронхоальвеолярную область промывали 1,5 мл раствора фосфатного буфера. Данный раствор после промывания собирали, и в этом растворе для промывания подсчитывали количество лейкоцитов и эозинофилов, соответственно. Дополнительно в легочных тканях с помощью окрашивания гематоксилином и эозином наблюдали инфильтрацию белых кровяных клеток в ткани, повреждения тканей и так далее, и, соответственно, определяли их масштаб. Экстракт Sophorae Subprostratae Radix вводили перорально через 7-10 дней после последней сенсибилизации.
Данные таблицы 3 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению обладает эффектом ингибирования воспаления дыхательных путей. В то время как эффект монтелукаста, положительного контроля, показывает насыщение фармацевтической эффективности при относительно низком уровне, и данный эффект не является дозозависимым, экстракт Sophorae Subprostratae Radix no настоящему изобретению, как показано, обладает значительным фармацевтическим эффектом, который является также дозозависимым. Пример 4: Ингибирование активности 5-липоксигеназы (5-липоксигеназа, 5-LO) Чтобы оценить ингибирующий эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix, приготовленного в Подготовительных Примерах 1-3, на лейкотриен-продуцирующий фермент, основную причину астмы, эксперимент проводили таким образом, как описано ниже; данные приведены в Таблице 4. [Методика] Мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека (PBML) стабилизировали в сбалансированном солевом растворе Хенка (HBSS) при 37°С, и затем добавляли экстракт Sophorae Subprostratae Radix, и давали возможность реагировать в течение 15 минут. К указанной смеси добавляли арахидоновую кислоту, в качестве основного вещества, и продуцировали лейкотриен В4 (LTB4) в течение 15 минут. Количество таким образом продуцированного LTB4 измеряли с использованием набора для иммуноферментного анализа (EIS).
Данные таблицы 4 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению обладает эффектом ингибирования активности 5-липоксигеназа. Пример 5: Ингибирование активности фосфодиэстеразы 4 (PDE4) Чтобы оценить ингибирующий эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix, приготовленного в Подготовительных Примерах 1-3, на фосфодиэстеразу 4, основную причину астмы, эксперимент проводили таким образом, как описано ниже; данные приведены в Таблице 5. [Методика] Клетки человека U937 стабилизировали в перемешиваемом растворе, содержащем 50 мМ Tris-HCl и 5 мМ МgСl2 (рН 7,5) при 25°С. Экстракт Sophorae Subprostratae Radix и 1,01 мкМ ([3Н]сАМР+сАМР), в качестве основного вещества, смешивали вместе (с клетками) и давали возможность реагировать в течение 20 минут с целью продуцирования аденозина. Количество таким образом продуцированного аденозина определяли путем измерения количества [3Н] аденозина.
Данные таблицы 5 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению обладает эффектом ингибирования активности фосфодиэстеразы 4. Пример 6: Антагонистическая активность в отношении рецептора лейкотриена D4 (LTD4) Чтобы оценить ингибирующий эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix, приготовленного в Подготовительных Примерах 1-3, на LTD4-рецептор, основную причину астмы, эксперимент выполняли таким образом, как описано ниже; данные приведены в Таблице 6. [Методика] LTD4-рецептор, изолированный из легочных тканей морской свинки линии Duncan Hartely, стабилизировали в буферном растворе, содержащем 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ CaCl2, 5 мМ MgCl2, 100 мкг/мл бацитрацина, 1 мМ бензамид, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, при 25°C. Затем к указанной смеси добавляли экстракт Sophorae Subprostratae Radix и 0,2 нМ [3H]LTD4 и давали возможность реагировать. Степень связывания анализировали с использованием методики радиолигандного связывания, а неспецифическое связывание определяли с помощью 0,1 мкМ LTD4. Степень специфического связывания: 85%, Kd: 0,2 нМ, Bmax: 0,24 пМ/мг белка.
Данные таблицы 6 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix no настоящему изобретению обладает эффектом ингибирования активности LTD4-рецепторов. Пример 7: Противокашлевой эффект Использованная методика представляла собой методику М.Н. Boskabady с соавт. (Journal of Entnopharmacology 97, 2005, 79-82) с небольшими модификациями. Самцу морской свинки линии Hartley (450~500 г, SLC, Япония) перорально вводили лекарство. Через 1 час после введения морскую свинку помещали в бокс двухкамерного плетизмографа (HSE, Германия) с установленным плетизмометром и стабилизировали, давая время на адаптацию 5 минут. После стабилизации на морскую свинку в течение 7 минут распыляли 0,6 М лимонную кислоту в аэрозольной форме с использованием сжатого под высоким давлением воздуха. За морской свинкой постоянно следил подготовленный наблюдатель, и количество случаев кашля, вызванного указанным распылением лимонной кислоты в аэрозольной форме, измеряли с использованием микрофона и громкоговорителя. Кашель отличали от обычного чихания по его особым признакам, таким как своеобразный и высокий звук с открыванием рта, движением брюшной полости и немедленное изменение в воздушном потоке.
Данные таблицы 7 подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix no настоящему изобретению обладает противокашлевым эффектом. Пример 8: Ингибирование гиперчувствительности дыхательных путей Самок мышей линии BALB/c в возрасте 6 недель (SLC, Япония) сенсибилизировали путем интраперитонеального введения 0,2 мл смеси, состоящей из 10 мкг OVA и алюминиевых квасцов, в 0-й, 7-й и 14-й дни, соответственно. Чтобы индуцировать гиперчувствительность дыхательных путей, соответственно, на 8-й и 10-й дни после данной сенсибилизации в течение 50 минут на мышей распыляли 0,7% OVA в аэрозольной форме с использованием сжатого под высоким давлением воздуха. Измерение гиперчувствительности дыхательных путей проводили в барометрической камере плетизмографа (АН Medicus, Seoul, Корея), при этом все мыши в камере находились в сознании и им позволяли свободно перемещаться. Основной используемый показатель гиперчувствительности дыхательных путей представлял собой среднее значение от всех измерений в течение 3 минут. Затем мышам делали ингаляцию метахолина в течение 3 минут при каждой концентрации метахолина, постепенно увеличивая концентрацию от 2,5 мг/мл до 50 мг/мл, и измеряли уровень гиперчувствительности дыхательных путей, соответственно, для каждой концентрации. Усовершенствованный показатель паузы (Penh), известный как хороший индекс, показывающий уровень сопротивления дыханию, рассчитывают на основе нижеследующего уравнения 1. [Уравнение 1] Усовершенствованный показатель паузы (Penh)=[время выдоха (Те)/ время релаксации (RT)-1]×[максимум воздушной струи при выдохе (РЕР)/максимум воздушной струи при вдохе (P1F)] При измерении сопротивления дыханию среднее значение Penh записывается каждые 10 секунд, и оно также указано на Фигурах с интервалом 1 минута. Данные, приведенные на Фиг.1, подтверждают, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению обладает ингибирующей активностью в отношении гиперчувствительности дыхательных путей. Пример 9: Ингибирование ремоделирования дыхательных путей Асептически обработанных самок мышей линии BALB/c в возрасте от восьми до десяти недель в 1-й день сенсибилизировали путем интраперитонеальной инъекции перемешанного раствора, содержащего 500 мкг OVA и 1,0 мг гидроокиси алюминия (первая обработка), и затем на 11-й день им делали ингаляцию 2% OVA, используя ультразвуковой распылитель (вторая обработка), и в заключение, на 21-й, 22-й и 23-й дни, им делали ингаляцию 3% OVA (третья обработка). Затем в течение следующих 6 недель с интервалами 3 дня мышей подвергали ингаляции 1% OVA и строили экспериментальную модель астмы с индуцированным ремоделированием дыхательных путей. Вечером за 24 часа до 3-ей OVA-ингаляции мышам один раз вводили экстракт (SOS), приготовленный в Подготовительном Примере 2. Во время 3-й OVA-ингаляции (на 21-й, 22-й и 23-й день) дважды в сутки мышам вводили экстракт (SOS), приготовленный в Подготовительном Примере 2, а именно, одно введение – за один час до ингаляции и другое введение – вечером в день 3-й ингаляции. В течение 8-недельного периода OVA-ингаляций с целью ремоделирования дыхательных путей мышам делали введение дважды в сутки. Для изучения ремоделирования дыхательных путей использовали следующие анализы. Анализ коллагена: методика количественного анализа уровня фиброза ткани. РАS (Шифф-иодная кислота)-окрашивание: методика измерения гиперплазии бокаловидных клеток. Окрашивание трихромом перибронхиальной области: методика определения уровня фиброза в перибронхиальной области у нижнего бронха путем окрашивания тканей с использованием окраски трихромом по Массону. Все бронхи имеют сходные размеры, на основе длины базальной мембраны, и для 10 выбранных таким образом бронхов в форме кольца получено среднее значение. Толщина базальной мембраны, на основе бронхиол, имеющих внутренний диаметр 150-200 мкм, указана в мкм, и отношение измерено с использованием программы для компьютерного анализатора изображений. Дополнительно, собранные легочные ткани фиксировали с использованием 10% раствора формальдегида и погружали в парафиновые блоки. Данные парафиновые блоки нарезали кусочками толщиной 1,5 мкм, приготавливая срезы. Приготовленные таким образом срезы использовали для наблюдения гистологических изменений в легких путем Н&Е-окрашивания. На Фиг.2 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию слизи в дыхательных путях легочных тканей OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Типичные PAS-окрашенные секции легких. Образцы отбирали через 48 часов после последней провокации у мышей, получавших ингаляцию физиологического раствора с введением физиологического раствора (А), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением физиологического раствора (В), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением монтелукаста (С), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 50 мг/кг (D), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 100 мг/кг (Е), и у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 200 мг/кг (F). Отрезки прямой показывают масштаб 50 мкм. Фиг.3 представляет собой гистограмму, показывающую эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию слизи в дыхательных путях легочных тканей OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Количество PAS- положительных и PAS-отрицательных эпителиальных клеток в отдельных бронхиолах подсчитывали через 48 часов после последней провокации у мышей, получавших ингаляцию физиологического раствора с введением физиологического раствора (SAL+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением физиологического раствора (OVA+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением монтелукаста (OVA+MONTE), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 50 мг/кг (OVA+SOS50), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 100 мг/кг (OVA+SOS100), и у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 200 мг/кг (OVA+SOS200). Прямоугольники представляют собой средние значения с SEM (со стандартной средней ошибкой) 6 независимых экспериментов. #, р<0,05 в сравнении с SAL+SAL; *, р<0,05 в сравнении с OVA+SAL. Доля положительно PAS-окрашенного эпителия дыхательных путей существенно увеличивалась через 48 часов после OVA-ингаляции по сравнению с соответствующей долей после ингаляции физиологического раствора (Фиг.2 и 3). Повышение доли положительно PAS-окрашенного эпителия дыхательных путей было существенно меньше при введении SOS или монтелукаста. На Фиг.4 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию На Фиг.5 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию Площадь иммуноокрашивания перибронхиального На Фиг.6 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на перибронхиальный фиброз в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Типичные окрашенные трихромом по Массону секции легких. Образцы отбирали через 48 часов после последней провокации у мышей, получавших ингаляцию физиологического раствора с введением физиологического раствора (А), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением физиологического раствора (В), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением монтелукаста (С), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 50 мг/кг (D), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 100 мг/кг (Е), и у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 200 мг/кг (F). Отрезки прямой показывают масштаб 50 мкм. На Фиг.7 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на фиброз в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Площадь перибронхиального окрашивания трихромом заделанного в парафин легкого измеряли через 48 часов после последней провокации у мышей, получавших ингаляцию физиологического раствора с введением физиологического раствора (SAL+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением физиологического раствора (OVA+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением монтелукаста (OVA+MONTE), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 50 мг/кг (OVA+SOS50), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 100 мг/кг (OVA+SOS100), и у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 200 мг/кг (OVA+SOS200). Прямоугольники представляют собой средние значения с SEM (со стандартной средней ошибкой) 6 независимых экспериментов. #, р<0,05 в сравнении с SAL+SAL; *, р<0,05 в сравнении с OVA+SAL. Площадь перибронхиального окрашивания трихромом существенно увеличивалась через 48 часов после OVA-ингаляции по сравнению с соответствующей площадью после ингаляции физиологического раствора (Фиг.6 и 7). Увеличение площади перибронхиального окрашивания трихромом было существенно меньше при введении SOS или монтелукаста. На Фиг.8 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на общее содержание коллагена в легких OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Количество коллагена в легких измеряли с использованием набора для анализа коллагена. Образцы отбирали через 48 часов после последней провокации у мышей, получавших ингаляцию физиологического раствора с введением физиологического раствора (SAL+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением физиологического раствора (OVA+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением монтелукаста (OVA+MONTE), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 50 мг/кг (OVA+SOS50), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 100 мг/кг (OVA+SOS100), и у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 200 мг/кг (OVA+SOS200). Прямоугольники представляют собой средние значения с SEM (со стандартной средней ошибкой) 6 независимых экспериментов. #, р<0,05 в сравнении с SAL+SAL; *, р<0,05 в сравнении с OVA+SAL. Уровни коллагена в легких существенно увеличивались через 48 часов после OVA-ингаляции по сравнению с соответствующим уровнем после ингаляции физиологического раствора (Фиг.8). Увеличение уровней коллагена в легких было существенно меньше при введении SOS или монтелукаста. Пример 10: Измерение уровней цитокинов (IL-4, 5 и 13) и OVA-специфического IgE с использованием вестерн-блоттинга Концентрацию цитокинов (IL-4, 5 и 13) в растворе после промывания легочных тканей и концентрацию OVA-специфического IgE в сыворотке измеряли с использованием набора для ELISA (цитокин: R&D systems, Abingdon, UK/ OVA-специфический IgE; BD sciences). На Фиг.9 показан эффект экстракта, приготовленного в Подготовительном Примере 2 (SOS), или монтелукаста на экспрессию белков IL-4, IL-5 и IL-13 в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей. Экспрессию белков IL-4, IL-5 и IL-13 измеряли через 48 часов после последней провокации у мышей, получавших ингаляцию физиологического раствора с введением физиологического раствора (SAL+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением физиологического раствора (OVA+SAL), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением монтелукаста (OVA+MONTE), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 50 мг/кг (OVA+SOS50), у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 100 мг/кг (OVA+SOS100), и у мышей, получавших OVA-ингаляцию с введением SOS 200 мг/кг (OVA+SOS200). Результаты 8 независимых экспериментов были похожи. Путем вестерн-блоттинга показано, что уровни белков IL-4, IL-5 и IL-13 в легочных тканях существенно увеличивались через 48 часов после OVA-ингаляции по сравнению с соответствующими уровнями после ингаляции физиологического раствора (Фиг.9). Увеличение уровней данных цитокинов было существенно меньше при введении SOS или монтелукаста. Пример 11: Определение токсичности при многократном пероральном введении на крысах Определение токсичности при многократном введении выполняли с использованием беспатогенных (SPF) SD-крыс в возрасте шести недель следующим образом. Экстракт Sophorae Subprostratae Radix, приготовленный в Подготовительных Примерах 1-3, суспендировали и вводили перорально крысам в количестве 2 г/кг в течение периода времени 2 недели. В каждой группе находилось шесть животных. После данного введения проводили наблюдения за смертностью, клиническими симптомами, изменением масса тела мышей, выполняли гематологические тесты и биохимические тесты крови. Затем мышей подвергали аутопсии с целью исследования невооруженным глазом любых аномалий в органах брюшной полости и грудной клетки. Данные результаты показали, что все мыши выжили и отсутствуют какие-либо конкретные признаки, относящиеся к клиническим симптомам. Дополнительно, не было обнаружено ничего существенного при определении токсичности в гематологических тестах и биохимических тестах крови, а также в аутопсиях. Следовательно, подтверждено, что экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению представляет собой безопасное вещество, которое не проявляет никакой токсичности в крысах вплоть до дозы 2000 мг/кг. Пример препарата 1: Приготовление таблеток Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению готовили в виде препарата в форме таблеток для перорального введения, имеющего следующую композицию, с использованием методик влажной грануляции и сухой грануляции. [Композиция] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 250 мг, безводный диоксид кремния 10 мг, стеарат магния 2 мг, микрокристаллическая целлюлоза 50 мг, натриевая соль гликолята крахмала 25 мг, кукурузный крахмал 113 мг, достаточное количество безводного этанола. Пример препарата 2: Приготовление мазей Экстракт Sophorae Subprostratae Radix no настоящему изобретению готовили в виде препарата в форме мази, имеющего следующую композицию. [Композиция] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 7 г, цетилпальмитат 20 г, цетиловый спирт 40 г, стеариловый спирт 40 г, изопропилмиристат 80 г, сорбитмоностеарат 20 г, полисорбат 60 г, пропилпарагидроксибензоат 1 г, метилпарагидроксибензоат 1 г, достаточное количество фосфата и очищенной воды. Пример препарата 3: Приготовление инъецируемых препаратов Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению готовили в виде инъецируемого препарата, имеющего следующую композицию. [Композиция] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 50 мг, маннит 180 мг, Na2HPO4 25 мг, дистиллированная вода для инъекций 2970 мг. Пример препарата 4: Приготовление агентов для местного введения Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению готовили в виде препаратов агентов для местного введения, имеющих следующие композиции. [Композиция 1] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 0,3 г, натрий-полиакрилат 1,3 г, глицерин 3.6 г, гидроксоалюминий 0,04 г, метилпарабен 0,2 г, вода 14 г. [Композиция 2] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 0,6 г, пропиленгликоль 1,6 г, вазелиновое масло 0,8 г, изопропилмиристат 0,4 г, акриловый клей 1430 г, вода 16,4 г. Пример препарата 5: Приготовление пастилок Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению готовили в виде препарата в форме пастилок, имеющего следующую композицию. [Композиция] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 1 г, белый сахар 50 г, желатин 3 г, глицерин 10 г, аравийская камедь 1 г, достаточное количество воды. Пример препарата 6: Приготовление сиропов Экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению готовили в виде препарата в форме сиропов, имеющего следующую композицию. [Композиция] Экстракт Sophorae Subprostratae Radix 2 г, сахарин 0,8 г, сахар 25,4 г, глицерин 8,0 г, корригент 0,04 г, этанол 4,0 г, сорбиновая кислота 0,4 г, достаточное количество дистиллированной воды. ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ Как указано выше, экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению в отличие от традиционных синтезированных фармацевтических лекарств, которые, как показано, являются эффективными только в ограниченном числе моделей респираторных заболеваний, проявил исключительную фармацевтическую эффективность во всех моделях респираторных заболеваний. То есть, экстракт Sophorae Subprostratae Radix по настоящему изобретению обладает исключительным эффектом ингибирования контракции дыхательных путей, респираторных инфекций, активности 5-липоксигеназы, активности фосфодиэстеразы 4, гиперчувствительности дыхательных путей и ремоделирования дыхательных путей; антагонистической активностью в отношении лейкотриена D4 и противокашлевым эффектом и, соответственно, является полезным для предупреждения и лечения респираторных заболеваний, таких как астма, острый и хронический бронхит, аллергический ринит, острые инфекции нижних дыхательных путей (бронхит, бронхиолит и так далее), острые инфекции верхних дыхательных путей (сфагит, тонзиллит, ларингит). Все документы, упомянутые в данном описании, полностью включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на конкретные воплощения, могут быть созданы модификации и изменения по изобретению с отступлениями от объема изобретения, который определен в нижеследующей формуле изобретения.
Формула изобретения
1. Фармацевтическое средство для лечения респираторных заболеваний, содержащее в качестве активного ингредиента водный или спиртовый экстракт Sophorae Subprostratae Radix или экстракт Sophorae Subprostratae Radix в неполярном растворителе. 2. Фармацевтическое средство по п.1, где указанный экстракт Sophorae Subprostratae Radix приготовлен путем экстракции Sophorae Subprostratae Radix водой или спиртовым раствором с последующей очисткой низшим спиртом или неполярным растворителем. 3. Фармацевтическое средство по п.1, где указанный экстракт Sophorae Subprostratae Radix приготовлен путем экстракции Sophorae Subprostratae Radix низшим спиртом или неполярным растворителем с последующей очисткой. 4. Фармацевтическое средство по п.2 или 3, где указанный низший спирт содержит от 1 до 6 атомов углерода и указанный неполярный растворитель представляет собой этилацетат, дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод или метилэтилкетон. 5. Фармацевтическое средство по п.1, где указанные респираторные заболевания представляют собой астму, острый или хронический бронхит, аллергический ринит, острую инфекцию верхних дыхательных путей и острую инфекцию нижних дыхательных путей. 6. Фармацевтическое средство по п.1, где указанные респираторные заболевания вызваны контракцией дыхательных путей, воспалением дыхательных путей, 5-липоксигеназой, фосфодиэстеразой 4, гиперчувствительностью дыхательных путей или ремоделированием дыхательных путей, лейкотриеном D4 и противокашлевым эффектом.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
буквы китайского алфавита. Его корни, которые после сушки используют в качестве лекарств, имеют форму длинных цилиндров и немного изогнуты, длиной 10-25-35 см, диаметром 0,3-1 см. Его поверхность, коричневая или темно-коричневая, имеет вертикально расположенные морщины и немного изогнутые длинные поры. Основное место произрастания данного продукта – провинция Гвансэо (Gwangseo) в Китае. В восточной медицине его использовали для лечения опухолей, отеков, болей, желтухи, диареи, геморроя и тому подобного. Его активные ингредиенты представляют собой алкалоиды, такие как матрин, оксиматрин, анагирин, метилцитизин и тому подобное, и флавониды, такие как софоранон, софорадин, софоранохромен, софорадохромен и тому подобное (Chinese Medicine Encyclopedia, Jungdam Publishing, pp.2627-2632, 1998). Однако эффект экстракта Sophorae Subprostratae Radix на респираторные заболевания еще не изучен.
-актина гладких мышц в легочных тканях OVA-сенсибилизированных и подвергнутых OVA-провокации мышей.
