Патент на изобретение №2390253

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА ИЗ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к молочной промышленности. Способ получения лактоферрина из молочного сырья включает в себя хроматографию лактоферрина из молочного сырья на колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05 М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию раствора лактоферрина. Способ отличается тем, что в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером рН 7,7 в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию с аналогичными параметрами, а затем выделенные фракции направляют на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию. Способ позволяет получить нативный лактоферрин чистотой не менее 98%.

Изобретение относится к молочной промышленности. Известен способ получения лактоферрина из женского молока, включающий обезжиривание, удаление казеинов, фракционирование сульфатом аммония, диализ и лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что фракционирование ведут ступенчато: сначала добавляют сульфат аммония до концентрации 35-45% от насыщения, осадок удаляют, затем к супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 70-80% от насыщения; а перед диализом осадок от фракционирования растворяют в дистиллированной воде, инкубируют с 1,3-3,7М хлоридом натрия при рН 3,6-4,4 и удаляют образующийся осадок при помощи фильтрования (см. патент РФ 1709606).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ получения лактоферрина из творожной или подсырной сыворотки методом ионообменной хроматографии с использованием ионообменной целлюлозы. Способ заключается в следующем: молочную сыворотку, полученную при производстве творога кислотным или кислотно-сычужным способами, нейтрализуют до рН 6,5 раствором гидроокиси натрия, центрифугируют для отделения иммуноглобулинов и фосфата кальция; далее подготовленную сыворотку подают на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенной буферным раствором рН 6,5, содержащим 50 мМоль натрия фосфорнокислого. Элюирование лактоферрина проводят с помощью 0,05М фосфатного буфера, содержащего 1,0 М хлористого натрия. Полученный раствор обессоливают ультрафильтрацией, подвергают микрофильтрации и лиофильно высушивают (см. ТИ ТУ 9224-001-93467423-06).

Недостатком этого способа является то, что в качестве сырья используется творожная или подсырная сыворотка, содержание лактоферрина в которой крайне ограничено, а также то, что получаемый лактоферрин в своем составе содержит примеси других сывороточных белков.

Задачей заявленного изобретения является создание способа получения лактоферрина из сырого коровьего молока, обеспечивающего получение лактоферрина чистотой не менее 98%.

Поставленная задача решена путем создания способа получения лактоферрина из молочного сырья, включающего хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05 М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизации раствора лактоферрина, в котором, согласно изобретению, в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина из сырого коровьего молока проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию лактоферрина во вторую колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина со второй колонки проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании вновь собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию.

Технический результат, проявляющийся при использовании созданного способа получения лакоферрина, заключается в получении нативного лактоферрина чистотой не менее 98% из сырого коровьего молока в качестве исходного сырья за счет двухэтапных адсорбции лактоферрина на карбокисметилцеллюлозе при рН 7,7 и элюирований белка с колонки 0,05 М натрий-фосфатным буфером в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2М, причем на первом этапе выделяют фракции с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм, выделенные фракции объединяют и направляют последовательно на вторую колонку с карбоксиметилцеллюлозой для второй хроматографии и элюирования.

Лактоферрин, согласно заявленному способу, получают следующим образом.

Сырое коровье молоко, имеющее кислотность 16-18°Т (рН 6,5-6,6), направляют без предварительной подготовки на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой для проведения первого этапа хроматографического выделения лактоферрина из сырого коровьего молока. Далее колонку заполняют 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7. В отличие от ранее известного способа рН буфера, равный 7,7 ед., позволяет максимально сорбировать лактоферрин из сырого коровьего молока на карбоксиметилцеллюлозе. Элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М с целью максимального извлечения лактоферрина из сорбента, в отличие от известного способа, где концентрация хлорида натрия в буфере была постоянной и составляла 1,0 моль/л. При элюирований выделяют и собирают фракции с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм. Собранные фракции раствора лактоферрина направляют последовательно на вторую колонку с карбоксиметилцеллюлозой для осуществления второго этапа хроматографии, параметры сорбции и элюирования которого такие же как на первом этапе. Применение двухэтапного метода хроматографии позволяет максимально извлечь лактоферрин из сырого коровьего молока. После второй хроматографии раствор лактоферрина направляют на ультрафильтр с размером пор 10 КДа для концентрирования белка. Далее проводят диализ раствора лактоферрина для удаления из него солей. После диализа проводят лиофилизацию раствора лактоферрина, в результате чего получается сухой препарат лактоферрина, сохраняющий свойства нативного лактоферрина.

Пример 1. Сырое коровье молоко в количестве 1 т (рН 6,55) направляют на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, проводят сорбцию лактоферрина 0,05М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюируют 0,05 М натрий-фосфатным буфером в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, собирая фракции с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм, фракции объединяют и направляют последовательно на вторую колонку с карбоксиметилцеллюлозой для второй хроматографии. После второй хроматографии раствор лактоферрина подвергают ультрафильтрации, диализу и лиофилизации. В результате получают сухой препарат лактоферрина в количестве 100 г, содержание лактоферрина в котором составляет 98%.

Формула изобретения

Способ получения лактоферрина из молочного сырья, включающий хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05 М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию раствора лактоферрина, отличающийся тем, что в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют выделенные фракции на вторую хроматографию лактоферрина во вторую колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина со второй колонки проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании вновь собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют выделенные фракции на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию.