Патент на изобретение №2390025

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, точнее к диагностике, а именно к способам исследования биологического материала. Предложен способ, который характеризуется тем, что проводят высокоселективную твердо-фазную экстракцию пробы мочи с последующим качественным и количественным определением содержания в моче следующих нуклеозидов: 1-метиладенозина (Z₁), уридина (Z₂), ксантозина (Z₃), 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) (Z₄), цитидина (Z₅) и NN-диметилгуанозина (Z₆), при этом вероятность наличия патологии молочной железы возрастает в случае увеличения количественного содержания в моче уридина, ксантозина, 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) и цитидина и уменьшения количественного содержания 1-метиладенозина и NN-диметилгуанозина, а оценку вероятности наличия патологии молочной железы рассчитывают путем определения значения прогнозирующей функции F по формуле: F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71, где Z_n – концентрация соответствующего нуклеозида в пробе мочи (мг/мл), _n – идентификационная функция соответствующего нуклеозида, F – прогнозирующая функция, и последующего сопоставления с диаграммой, учитывающей возраст пациентки. 9 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования или анализа биологических материалов, а именно мочи, и может быть использовано для прогнозирования опухолевых заболеваний молочной железы (далее – МЖ).

Актуальность проблемы диагностики опухолевых заболеваний МЖ на ранних стадиях развития болезни не вызывает сомнений. В последнее время в литературе встречается большое количество работ, посвященных изучению возможности использования измененных и неизмененных нуклеозидов в моче в качестве маркеров для ранней диагностики и контроля протекания онкологических заболеваний. В отдельных работах показана принципиальная возможность использования ряда нуклеозидов в качестве маркеров раковых заболеваний, однако ни в одной из них не представлен полный законченный цикл исследований, в частности рака МЖ, подтверждающих возможность использования нуклеозидов в качестве маркеров и алгоритм, который позволил бы проводить диагностику.

При проведении качественного и количественного анализа нуклеозидов в литературе рекомендуется использовать наиболее широко распространенные хроматографические колонки, сорбентом в которых является силикагель с привитыми углеводородными радикалами. Однако как показал опыт, такие колонки малоэффективны для разделения гидрофильных соединений одного класса в силу ряда недостатков:

– недостаточная селективность при анализе сложных систем, содержащих большое количество компонентов одного класса с близкими физико-химическими свойствами,

– недостаточная химическая устойчивость сорбента при работе с подвижными фазами, содержащими большое количество воды, приводящая к нестабильным временам удерживания определяемых соединений.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи выявления совокупности признаков, позволяющих провести диагностику и сделать вывод о возможном наличии или отсутствии у пациентки патологии МЖ и необходимости проведения инструментального обследования.

Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) результатов:

– повышение селективности по отношению к исследуемым нуклеозидам, сокращение промежутка времени, необходимого для разделения большого количества нуклеозидов, а также уменьшение дрейфа времени выхода исследуемых нуклеозидов за счет использования хроматографической колонки, в которой сорбентом является силикагель с привитыми углеводородными цепями, дополнительно содержащими гидрофильные функциональные группы;

– возможность внесения поправок, учитывающих влияние различных факторов на всех стадиях анализа за счет использования системы двух внутренних стандартов;

– увеличение достоверности определения вероятности наличия патологии МЖ, в том числе онкологического заболевания, за счет использования расчета абсолютного содержания, относительного содержания и изменения содержания каждого из выбранных нуклеозидов.

Сущность изобретения заключается в следующем.

В результате проведенных исследований авторами заявляемого изобретения установлено, что наиболее информативным для оценки риска наличия у пациентки патологии, в том числе опухолевого заболевания, МЖ является количественное содержание в пробе мочи следующих нуклеозидов: 1-метиладенозин (Z₁), уридин (Z₂), ксантозин (Z₃), 5-дезокси-5-метилтиоаденозин (МТА) (Z₄), цитидин (Z₅), NN-диметилгуанозин (Z₆). Установлено также, что вероятность наличия патологии МЖ возрастает в случае увеличения количественного содержания в моче уридина, ксантозина, 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) и цитидина и уменьшения количественного содержания 1-метиладенозина и NN-диметилгуанозина.

Авторами изобретения разработана методика оценки вероятности наличия патологии МЖ путем определения значения прогнозирующей функции F по формуле: F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71, где

– Z_n – концентрация соответствующего нуклеозида в пробе мочи (мг/мл);

– _n – идентификационная функция;

– F – прогнозирующая функция,

и последующего сопоставления с диаграммой, учитывающей возраст пациентки.

Определены также значения идентификационной функции _n для каждого из шести выбранных нуклеозидов в зависимости от концентрации соответствующего нуклеозида в пробе мочи, а именно:

₁ для нуклеозида 1-метиладенозина (Z₁) имеет значение:

– ₁=0 при 0124,7045,

– ₁=-(Z₁-24,7045)·0,9749 при 24,70451<34,7347,

– ₁=-9,7781-(Z₁-34,7347·0,1245) при 34,73471<240,3545,

– ₁=-35,3801 при 240,35451;

₂ для нуклеозида уридина (Z₂) имеет значение:

– ₂=О при 02<1,7842,

– ₂=(Z₂-1,7842)·6,6095 при 1,784223,0340,

– ₂=8,2605 при 3,03402;

₃ для нуклеозида ксантозина (Z₃) имеет значение:

– ₃=0 при 030,0142,

– ₃=(Z₃-0,0142)·8,7356 при 0,014231,5389,

– ₃=13,3191 при 1,53893;

₄ для нуклеозида 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) (Z₄) имеет значение:

– ₄=Z₄ 1,677 при 0436,6236;

– ₄=61,43 при 36,62364;

₅ для нуклеозида цитидина (Z₅) имеет значение:

– ₅=0 при 050,1249,

– ₅=(Z₅-0,1249)·24,889 при 0,124950,8202,

– ₅=17,3053 при 0,82025;

₆ для нуклеозида NN-диметилгуанозина (Z₆) имеет значение:

– ₆=0 при 06<79,0336,

– ₆=-(Z₆-79,0336)·0,68 при 79,03366103,3472,

– ₆=-16,53-(Z₆-103,3472)·0,081 при 103,34726879,95,

– ₆=-79,5 при 879,95.

Авторами изобретения усовершенствована методика подготовки пробы мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу. Пробоподготовка включает получение конечного экстракта нуклеозидов путем проведения высокоселективной твердо-фазной экстракции на концентрирующем полимерном патроне. Для извлечения нуклеозидов из мочи используют сорбент Affi-gel 601^® с привитыми фенил-боронатными группами. Для равномерной подачи используют систему стабилизированной подачи растворов реагентов с постоянным объемным расходом с использованием полуавтоматического устройства на основе шприцевого насоса.

Для учета степени извлечения нуклеозидов на первой стадии пробоподготовки в пробу вводят известное количество 1-метилгуанозина (д3). При дальнейшем проведении количественного анализа выбранных нуклеозидов сопоставление с количеством 1-метилгуанозина (д3) в пробе, прошедшей стадию пробоподготовки, предоставляет возможность определить достигнутую на концентрирующем патроне степень извлечения исследуемых нуклеозидов.

Для повышения точности качественного и количественного определения широкого спектра нуклеозидов путем хроматографического анализа проб мочи была использована колонка, в которой сорбентом является силикагель с привитыми углеводородными цепями, дополнительно содержащими гидрофильные функциональные группы. В качестве такой колонки оптимальной была выбрана Synergi Polar RP 250×2 мм. Использование хроматографической колонки с указанным сорбентом позволяет работать с подвижными фазами, содержащими большое количество воды. В ходе работы установлено, что ее селективность по отношению к исследуемым нуклеозидам выше, чем селективность хроматографических колонок, в которых сорбентом является силикагель с привитыми углеводородными радикалами. Это позволило проводить разделение большего количества нуклеозидов за меньший промежуток времени. Также ввиду химической устойчивости неподвижной фазы к действию подвижных фаз с большим содержанием воды метрологические характеристики для данной хроматографической колонки такие, как дрейф времен удерживания, дрейф коэффициентов селективности, лучше, чем для колонок, в которых сорбентом является силикагель с привитыми углеводородными радикалами. В частности, при использовании колонки Synergi Polar RP 250×2 мм наблюдалось уменьшение дрейфа времени выхода исследуемых нуклеозидов в 3-4 раза.

В ходе анализа исследуемых проб решающее значение играет правильная идентификация хроматографических пиков, а также точное определение концентраций исследуемых нуклеозидов. Для подтверждения правильности идентификации дополнительно к времени удерживания определяемого соединения на хроматографической колонке авторами была использована процедура расчета отношений площадей пиков гидратированного молекулярного и фрагментного ионов. При правильной идентификации отношения площадей пиков для одного нуклеозида в пробе и в смеси стандартов должны отличаться не более чем на 10%. Количественное определение проводят с использованием калибровочных графиков, представляющих собой отношение площади пиков с m/z, соответствующих гидратированному молекулярному иону и фрагментному иону каждого из выбранных нуклеозидов к площади пика, соответствующего гидратированному иону 1-метилгуанозина (д3) m/z 286.2. Калибровочные графики получены с использованием метода построения истинных калибровочных на реальной матрице мочи в диапазоне концентраций от 0 до 20 мкг/мл нуклеозида в экстракте пробы после проведения процедуры пробоподготовки.

В связи со сложностью и большим количеством стадий используемой методики задача точного определения концентраций исследуемых нуклеозидов является весьма сложной. Для ее решения авторами разработана система двух внутренних стандартов для внесения поправок на различные факторы на всех стадиях анализа. В качестве внутренних стандартов используют 1-метилгуанозин (д3) для контроля стадии пробоподготовки, который вводят в пробу мочи перед проведением высокоселективной твердо-фазной экстракции, и 1-метилинозин (д3) для контроля процедуры проведения количественного анализа, который вводят в конечный экстракт пробы мочи.

Введение в пробу известного количества 1-метилгуанозина (д3) на стадии пробоподготовки позволяет учесть различную степень извлечения нуклеозидов на концентрирующем патроне. При дальнейшем проведении количественного анализа и определении количества 1-метилгуанозина (д3) в пробе, прошедшей стадию пробоподготовки, становится возможным определить достигнутую на концентрирующем патроне степень извлечения исследуемых нуклеозидов.

В ходе проведения количественного анализа с использованием масс-спектрометрического детектора может наблюдаться изменение его чувствительности к исследуемым нуклеозидам, связанное с различными факторами, одним из которых является варьирование степени ионизации исследуемых нуклеозидов. Для повышения точности количественного анализа и учета изменения чувствительности масс-спектрометрического детектора к исследуемым нуклеозидам авторы используют 1-метилинозин (д3), известное количество которого вводится в пробу непосредственно перед проведением хроматографического анализа. При использовании в качестве аналитического сигнала отношения площади хроматографического пика, соответствующего исследуемому нуклеозиду к площади пика, соответствующего внутреннему стандарту 1-метилинозин (д3), становится возможным внести поправку на изменение чувствительности масс-спектрометрического детектора к исследуемым нуклеозидам и нивелировать влияние ряда других факторов, вносящих ошибку, и повысить точность количественного определения концентраций нуклеозидов.

Таким образом, использование системы внутренних стандартов позволяет вносить поправки, отражающие различную степень извлечения исследуемых нуклеозидов на концентрирующем патроне, а также точность измерения масс-спектрометрического детектора.

Разработанный авторами метод анализа и математической обработки результатов определения количественного содержания выбранных нуклеозидов в моче, а именно: расчет абсолютного содержания, относительного содержания и изменения содержания каждого из выбранных нуклеозидов, позволяет с большей достоверностью определять вероятность (прогнозировать) наличия или отсутствия патологии МЖ, в том числе онкологического заболевания, без усложнения процедуры пробоподготовки и без увеличения продолжительности анализа.

Для расчета диагностического параметра авторами предложено использование многопараметрического анализа, включающего отбор информативных показателей концентрации нуклеозидов Z_n, расчет идентификационных функций _n и прогнозирующей функции F, а также оценку вероятности патологии МЖ с учетом возраста пациентки.

Таким образом, использование совокупности перечисленных существенных признаков позволило усовершенствовать методику высокоэффективной жидкостной хроматографии пробы мочи и сформировать группы с различной вероятностью риска наличия патологии МЖ

Способ осуществляют следующим образом.

1. Получение образцов мочи.

Произвольно собранную порцию мочи как можно раньше после ее получения и доставки в лабораторию охлаждают при 4-7°С максимум 24 часа и затем глубоко замораживают при – 20°С. До замораживания в моче проводят определение концентрации креатинина (мкмоль/л) по методу Яффе тест-наборами фирмы «Roche» на автоматическом биохимическом анализаторе «Hitachi-902». Кроме того, определяют содержание белка, нитритов и лейкоцитов при помощи тестовой полоски для мочи (Combi-Screen).

2. Условия хроматографического разделения.

– Хроматографическая колонка для жидкостной хроматографии, заполненная сорбентом Synergi Polar PR 250×2,0 мм, 4 мкм, длиной 250 мм, внутренним диаметром 2,0 мм и диаметром зерна сорбента 4 мкм

– Состав подвижной фазы: А – водный раствор 20 мМ ацетата аммония, рН 6.9; В – ацетонитрил;

– Скорость подачи подвижной фазы: 200 мкл/мин;

– Условия градиентного элюирования:

– Ввод пробы с помощью автоматической системы для ввода пробы 20 мм³.

3. Количественный анализ измененных и неизмененных нуклеозидов в моче.

Идентификацию 1-метиладенозина, уридина, ксантозина, 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА), цитидина, NN-диметилгуанозина выполняют по времени удерживания, являющемуся качественной характеристикой, с помощью диодно-матричного спектрофотометрического детектора, и масс-спектрометрическим данным.

Конечный экстракт нуклеозидов получают путем высокоселективного выделения с использованием фенилборонатного геля, полуавтоматического устройства на основе шприцевого насоса. Разделение нуклеозидов происходит в хроматографической колонке путем прямого детектирования компонентов с масс-спектрометрическим квадрупольным детектором в режиме сканирования выбранных ионов (SIM), с точностью определения m/z – 0.1 а.е.м. и записи сигнала детектора в цифровом формате.

Для подтверждения правильности идентификации используют процедуру расчета отношений площадей пиков гидратированного молекулярного и фрагментного ионов. При правильной идентификации отношения площадей пиков для одного нуклеозида в пробе и в смеси стандартов отличается не более чем на 10%.

Количественное определение проводят с использованием калибровочных графиков, построенных с использованием метода построения истинных калибровочных на реальной матрице мочи в диапазоне концентраций от 0 до 200 мкг/мл нуклеозида в экстракте пробы после проведения процедуры пробоподготовки.

Для достоверного проведения количественного анализа вводят внутренние стандарты: тридейтерированные 1-метилгуанозин (д3) для контроля процедуры пробоподготовки и 1-метилинозин (д3) для контроля процедуры проведения измерения. С использованием системы данных двух внутренних стандартов были построены калибровочные зависимости для определения содержания нуклеозидов в готовых экстрактах проб после процедуры пробоподготовки.

Данная методика была апробирована на ВЭЖХ системе Agilent 1100 (Agilent, США), оснащенной диодно-матричным детектором, термостатом колонки, градиентным элюированием, автоматической системой ввода пробы или любой другой, обеспечивающей подобные или лучшие характеристики. Сбор и обработку информации о составе анализируемых проб проводили с помощью программного обеспечения Chemstation®.

4. Алгоритм оценки вероятности наличия опухолевого заболевания молочной железы состоит в следующем

– для пациентки измеряют признаки Z₁, Z₂, Z₃, Z₄, Z₅, Z₆,

– по приведенным выше формулам или по диаграммам (Фиг.1-6) вычисляют значения идентификационных функций ₁, ₂, ₃, ₄, ₅, ₆,

– определяют значение прогнозирующей функции F,

– найденное значение прогнозирующей функции F сопоставляют с таблицей 1 и определяют значение оценки апостериорной вероятности отсутствия и наличия патологии МЖ.

Зависимости величины указанных идентификационных функций (_n) от количественного содержания соответствующего нуклеозида в пробе мочи (Z_n) (площади хроматографического пика) проиллюстрированы следующими графиками:

– Фиг.1 – значение идентификационной функции ₁ для нуклеозида 1-метиладенозин (Z₁) в зависимости от площади хроматографического пика Z₁,

– Фиг.2 – значение идентификационной функции ₂ для нуклеозида уридин (Z₂) в зависимости от площади хроматографического пика (Z₂),

– Фиг.3 – значение идентификационной функции ₃ для нуклеозида ксантозин (Z₃) в зависимости от площади хроматографического пика (Z₃),

– Фиг.4 – значение идентификационной функции ₄ для нуклеозида 5-дезокси-5-метилтиоаденозин (МТА) (Z₄) в зависимости от площади хроматографического пика (Z₄),

– Фиг.5 – значение идентификационной функции ₅ для нуклеозида цитидин (Z₅) в зависимости от площади хроматографического пика (Z₅),

– Фиг.6 – значение идентификационной функции ₆ для нуклеозида NN-диметилгуанозин (Z₆) в зависимости от площади хроматографического пика (Z₆).

Примеры выполнения

Достоверность предлагаемого способа прогнозирования опухолевых заболеваний МЖ подтверждают следующие статистические данные. Контроль выполнен на группе из 199 пациенток. Пациентки были разбиты на 7 групп: 1 – контрольная группа (27 случаев); 2 – группа с мастопатией (21 случай); 3 – группа с фиброаденомой (13 случаев); 11, 12, 13, 14 – группы с заболеванием раком МЖ в порядке возрастания стадии заболевания. Кроме того, были использованы следующие значения априорных вероятностей наличия больных опухолевыми заболеваниями МЖ, полученные по медицинской статистике России:

₁ (здоровые/возраст менее 30 лет)=0.75; ₂ (больные/возраст менее 30 лет)=0.25.

₁ (здоровые/возраст от 30 до 40 лет)=0.6; ₂ (больные/возраст от 30 до 40 лет)=0.40.

₁ (здоровые/возраст от 40 до 55 лет)=0.2; ₂ (больные/возраст от 40 до 55 лет)=0.8.

Примеры диагностики.

Контрольная группа состояла из женщин в возрасте от 16 до 58 лет (практически здоровые женщины, женщины с верифицированной мастопатией и фиброаденомой).

Условия отбора женщин в эту группу были следующие:

– отсутствие злокачественных заболеваний на момент исследования и в течение всей жизни;

– отсутствие инфекций или заболеваний во время исследования;

– отсутствие недавно проведенных операций;

– отсутствие серьезных хронических заболеваний, особенно почечной недостаточности;

– отсутствие беременности во время исследования.

Группа женщин с раком МЖ включала больных, страдающих раком МЖ, в возрасте от 29 до 72 лет, находящихся на лечении в клинике МНИОИ им. П.А.Герцена. Пробы мочи произвольно собирали перед операцией и глубоко замораживали при – 20°С. У пациенток были опухоли в стадиях рака in situ (базальная мембрана не имеет повреждений), Т1 (размер опухоли до 2 см) и Т2 (размер опухоли от 2 до 5 см).

Для включения в группу исследуемых пациентки должны были удовлетворять следующим критериям:

– женщины в возрасте 14 лет и старше;

– гистологически подтвержденный диагноз рака МЖ;

– наличие препарата опухолевой ткани для пересмотра;

– отсутствие в клиническом анамнезе химиолучевого лечения;

– наличие измеряемых проявлений болезни;

– общее состояние по шкале ECOG2;

– лабораторные показатели в пределах нормы: гематологические (гемоглобин, абсолютное число нейтрофилов, число тромбоцитов), уровень сывороточного креатинина, клиренс креатинина, показатели функции печени (общий билирубин, ACT, АЛТ, альбумин.

1. Пациентка А52, контрольная группа. Значения признаков:

значения функций :

₁=-19,22

₂=0

₃=3,31

₄=10,58

₅=17,31

₆=-23,04

Графический способ определения функций состоит в подстановке значений признаков Z в соответствующие диаграммы Фиг.1-6.

Значение прогнозирующей функции F

F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71=59,8

При сопоставлении значения прогнозирующей функции F=59,8 с таблицей 1 получаем:

1) если возраст пациентки А52 меньше 30 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,01 (т.е. риск заболевания составляет 1%),

2) если возраст пациентки А52 от 30 до 40 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,02 (т.е. риск заболевания составляет 2%),

3) если возраст пациентки А52 от 40 до 55 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,11 (т.е. риск заболевания составляет 11%).

2. Пациентка В48, контрольная группа. Значения признаков:

По формулам определены значения функций :

₁=-18,35

₂=1,45

₃=0,10

₄=10,89

₅=17,31

₆=-27,70

Графический способ нахождения функций состоит в подстановке значений признаков Z в соответствующие диаграммы Фиг.1-6.

Значение прогнозирующей функции F

F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71=54,55

При сопоставлении значения прогнозирующей функции F=54,55 с таблицей 1 получаем:

– если возраст пациентки В48 меньше 30 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,01 (т.е. риск заболевания составляет 1%),

– если возраст пациентки В48 от 30 до 40 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,02 (т.е. риск заболевания составляет 2%),

– если возраст пациентки В48 от 40 до 55 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,11 (т.е. риск заболевания составляет 11%).

3. Пациентка А34, группа – мастопатия. Значения признаков:

По формулам определены значения функций :

₁=-18,52

₂=8,26

₃=10,64

₄=10,60

₅=17,31

₆=-22,33

Графический способ нахождения функций состоит в подстановке значений признаков Z в соответствующие диаграммы Фиг.1-6.

Значение прогнозирующей функции F

F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71=76,81

При сопоставлении значения прогнозирующей функции F=76,81 с таблицей 1 получаем:

– если возраст пациентки А34 меньше 30 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,74 (т.е. риск заболевания составляет 74%),

– если возраст пациентки А34 от 30 до 40 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,85 (т.е. риск заболевания составляет 85%),

– если возраст пациентки А34 от 40 до 55 лет, то оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 0,97 (т.е. риск заболевания составляет 97%).

4. Пациентка А18, группа – фиброаденома. Значения признаков:

По формулам определены значения функций :

₁=0,00

₂=0,00

₃=8,56

₄=10,94

₅=17,31

₆=-22,03

Графический способ нахождения функций состоит в подстановке значений признаков Z в соответствующие диаграммы Фиг.1-6.

Значение прогнозирующей функции F

F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71=85,63

При сопоставлении значения прогнозирующей функции F=85,63 с таблицей 1 получаем – при любом возрасте пациентки А18 оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 1 (т.е. риск заболевания составляет 100%).

5. Пациентка 72В, группа – рак МЖ, I стадия. Значения признаков:

По формулам приближенно находим значения функций :

₁=0,00

₂=8,26

₃=2,73

₄=10,94

₅=17,31

₆=-18,78

Графический способ нахождения функций состоит в подстановке значений признаков Z в соответствующие диаграммы Фиг.1-6.

Значение прогнозирующей функции F

F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71=91,12

При сопоставлении значения прогнозирующей функции F=91,12 с таблицей 1 получаем – при любом возрасте пациентки 72В оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 1 (т.е. риск заболевания составляет 100%).

6. Пациентка В3, группа – рак, II стадия. Значения признаков:

По формулам приближенно находим значения функций :

₁=0,00

₂=0,00

₃=6,71

₄=4,45

₅=14,29

₆=-3,33

Графический способ нахождения функций состоит в подстановке значений признаков Z в соответствующие диаграммы Фиг.1-6.

Значение прогнозирующей функции F

F=₁(Z_i)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71=92,97

При сопоставлении значения прогнозирующей функции F=92,97 с таблицей 1 получаем – при любом возрасте пациентки 72В оценка вероятности опухолевого заболевания составляет 1 (т.е. риск заболевания составляет 100%).

Формула изобретения

1. Способ прогнозирования опухолевых заболеваний молочной железы, характеризующийся тем, что подготовку пробы мочи к анализу осуществляют путем проведения высокоселективной твердофазной экстракции, идентификацию нуклеозидов и количественное определение содержания нуклеозидов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на гидрофильной колонке с градиентным элюированием с масс-спектрометрическим детектированием, идентификацию каждого из выбранных нуклеозидов осуществляют в режиме селективного детектирования по времени хроматографического удерживания и масс-спектрометрическим характеристикам: интенсивностям сигналов по двум выделенным ионам для каждого соединения и отношения интенсивностей площадей сигналов в точке максимума хроматографического пика для нуклеозидов, регистрируемых по двум ионам, количественный анализ каждого из выбранных нуклеозидов осуществляют с использованием системы двух внутренних стандартов, в качестве которых используют 1-метилгуанозин (д3), вводимый в пробу мочи перед проведением высокоселективной твердофазной экстракции, и 1-метилинозин (д3), вводимый в конечный экстракт пробы мочи непосредственно перед хроматографическим анализом, осуществляют качественное и количественное определение содержания в моче следующих нуклеозидов: 1-метиладенозина (Z₁), уридина (Z₂), ксантозина (Z₃), 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) (Z₄), цитидина (Z₅) и NN-диметилгуанозина (Z₆), причем вероятность наличия патологии молочной железы возрастает в случае увеличения количественного содержания в моче уридина, ксантозина, 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) и цитидина и уменьшения количественного содержания 1-метиладенозина и NN-диметилгуанозина, рассчитывают величину прогнозирующей функции и оценивают вероятность наличия патологии, при этом оценку вероятности наличия патологии молочной железы рассчитывают путем определения значения прогнозирующей функции F по формуле: F=₁(Z₁)+₂(Z₂)+₃(Z₃)+₄(Z₄)+₅(Z₅)+₆(Z₆)+71,
где Zn – концентрация соответствующего нуклеозида в пробе мочи, мг/мл,
_n – идентификационная функция соответствующего нуклеозида,
F – прогнозирующая функция,
и последующего сопоставления с диаграммой, учитывающей возраст пациентки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что высокоселективную твердофазную экстракцию осуществляют с использованием сорбента с привитыми фенил-боронатными группами.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что высокоселективную твердофазную экстракцию осуществляют с помощью системы стабилизированной подачи растворов реагентов с постоянным объемным расходом.

4. Способ по п.9, отличающийся тем, что система стабилизированной подачи растворов реагентов с постоянным объемным расходом снабжена полуавтоматическим устройством на основе шприцевого насоса.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификационная функция ₁ для нуклеозида 1-метиладенозина (Z₁) имеет следующее значение:
₁=0 при 0124,7045,
₁=-(Z₁-24,7045)·0,9749 при 24,7045134,7347,
₁=-9,7781-(Z₁-34,7347)·0,1245 при 34,73471240,3545,
₁=-35,3801 при 240,35451.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификационная функция ₂ для нуклеозида уридина (Z₂) имеет следующее значение:
₂=0 при 021,7842,
₂=(Z₂-1,7842)·6,6095 при 1,784223,0340,
– ₂=8,2605 при 3,03402.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификационная функция ₃ для нуклеозида ксантозина (Z₃) имеет следующее значение:
₃=0 при 030,0142,
₃=(Z₃-0,0142)·8,7356 при 0,014231,5389,
₃=13,3191 при 1,53893.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификационная функция ₄ для нуклеозида 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) (Z₄) имеет следующее значение:
₄=Z₄ 1,677 при 0436,6236;
₄=61,43 при 36,62364.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификационная функция ₃ для нуклеозида цитидина (Z₅) имеет следующее значение:
₅=0 при 050,1249,
₅=(Z₅-0,1249)·24,889 при 0,124950,8202,
₅=17,3053 при 0,8202Z₅.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификационная функция ₆ для нуклеозида NN-диметилгуанозина (Z₆) имеет следующее значение:
₆=0 при 0679,0336,
₆=-(Z₆-79,0336)·0,68 при 79,03366103,3472,
₆=-16,53-(Z₆-103,3472)·0,081 при 103,34726879,95.

РИСУНКИ