Патент на изобретение №2389792

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности. Пищевую карбоксиметилцеллюлозу растворяют в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10 и добавляют к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин. Образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5 и оставляют на сутки в холодильнике. Выпавшие частицы отделяют из раствора и неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают. Это позволяет уменьшить размер частиц иммобилизованной липазы, что способствует увеличению скорости ферментативного процесса.

Изобретение относится к нанотехнологиям и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности.

В настоящее время известны многочисленные методы иммобилизации различных ферментов, включая и липазы, самыми разнообразными способами, например их включением в различные биополимеры (см. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Экологические основы биотехнологии. – М.: МГУЛ, 2006. – С.105-106). Ближайшим аналогом к предлагаемому способу является способ получения иммобилизованной липазы, предусматривающий смешивание 1 мг липазы из поджелудочной железы (фирма Сигма) или микробной липазы из Mucor javanicus (фирма Сигма) и полистиролсульфоната натрия в соотношении 1:1-100 при комнатной температуре, рН 7,6-8,2 в течение 10-20 мин (патент РФ 2308486 С1, 20.10.2006 г.).

Основным недостатком всех этих способов является использование в качестве носителя преимущественно синтетических полимеров, которые невозможно использовать в пищевой и медицинской промышленностях. Кроме того, в результате получения подобных биокатализаторов размер частиц обычно составляет 100-200 мкм, что не позволяет использовать их в медицинской практике, так как с их помощью нельзя получать истинные растворы, необходимые для инфузионной и других видов терапии.

Задача, решаемая данным изобретением, заключается в разработке способа включения липаз в частицы размером 250-300 нм, которые дают возможность использовать полученные биокатализаторы в самых разнообразных целях, включая медицину и пищевую промышленность.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе получения иммобилизованной липазы, заключающемся в растворении носителя в растворе с добавлением порошка фермента с активностью не ниже 100 ед./г, в качестве носителя используют пищевую карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в качестве фермента – липазу, продуцируемые культурами животных панкреатических клеток и Aspergillus niger в виде порошка, иммобилизацию проводят в буферных растворах или в подщелоченной дистиллированной воде с pH 9,5-10 в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего рН реакционной смеси уменьшают до значения рН 3,0-3, 5, выпавшие частицы липазы вместе с ферментом отделяют и высушивают.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. 10 г пищевой карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) добавляют к 50 мл боратного буфера, имеющего рН 9,5, и реакционную смесь перемешивают до максимального растворения КМЦ. Полученный раствор фильтруют и добавляют к фильтрату 1 г панкреатической липазы с активностью 150 ед./г и 3 мл 1,5%-ного раствора ПАВ, например твин 40. Раствор интенсивно перемешивают при помощи вибротуракса со скоростью 4500-5000 об/мин в течение 60 мин и образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, после чего подкисляют ее соляной кислотой до значения рН 3,0-3,5. Эмульсию помещают на сутки в холодильник, через каждые 3-3,5 ч снова подвергают всю смесь перемешиванию при помощи вибротуракса. Спустя сутки раствор вновь перемешивают при помощи вибротуракса. Полученные частицы отделяют от реакционной массы центрифугированием со скоростью 5000 об/мин, после чего отделившийся раствор сливают, а к оставшимся частицам добавляют по 10 мл ацетатного буфера с рН 4-4,5. Операцию повторяют 2-3 раза, каждый раз подвергая реакционную массу перемешиванию вибротураксом. После этого раствор снова центрифугируют. Оставшуюся массу переносят в колбы или пенициллиновые флаконы по 1 мл во флакон и высушивают на сублимационной сушилке.

Выход полученных частиц составляет 80%, активность нейтральной липазы составляет 130-142 ед./г. Размер полученных частиц биокатализатора равен 250-260 нм.

Пример 2. Опыт проводят аналогично примеру 1, но вместо буфера используют подщелоченную дистиллированную воду, в качестве фермента берут микробную липазу из культуры Aspergillus niger с активностью 200 ед./г, в качестве ПАВ 1 мл 1%-ного раствора твин 20. Выход частиц вместе с включенным в них ферментом составляет 75%. Активность протеаз составляет 179-190 ед./г, размер частиц 260-270 нм.

Пример 3. Опыт проводят аналогично примеру 1, но в качестве фермента используют смесь липаз обоих видов, взятых в соотношении 1:1, а в качестве ПАВ-Спан-85. Выход биокатализатора составляет 80%. Активность 90 ед./г. Размер частиц 280-300 нм.

Таким образом, изобретение позволяет получать иммобилизированные липазы с размером частиц 250-300 нм, которые могут быть с успехом использованы в пищевой и медицинской промышленности.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной липазы с размером частиц 250-300 нм, заключающийся в растворении пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавлении к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.