Патент на изобретение №2389027

(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ У ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к детской эндокринологии и неврологии. Сущность способа заключается в том, что у пациента, страдающего сахарным диабетом 1 типа (СД), с отсутствием клинических проявлений церебральных нарушений, в сыворотке крови определяют уровень белка S-100B. При повышении его уровня более 140 нг/л диагностируют субклиническую стадию диабетической энцефалопатии (ДЭ). Использование способа позволяет повысить точность и объективность диагностики ДЭ на ранних стадиях, что дает возможность своевременно и обоснованно назначать адекватную терапию, тем самым предупреждая развитие тяжелых церебральных осложнений СД.

Изобретение относится к области медицины, а именно к детской эндокринологии и неврологии, и найдет широкое применение для ранней диагностики поражения мозга – диабетической энцефалопатии, у детей, страдающих сахарным диабетом 1 типа (СД).

Поражение мозга при СД – диабетическая энцефалопатия (ДЭ), приводя к нарушениям высших психических функций больных, ухудшает адаптационные возможности больных СД, прогноз трудоустройства и социальной реабилитации.

Диабетическая энцефалопатия характеризуется процессами нейронального апоптоза вследствие результата токсического действия хронической гипергликемии, а также признаками гипоксически-ишемического повреждения вследствие формирующихся микрососудистых нарушений (церебральной микроангиопатии) (Sima AA, Kamiya H, Kamiya H, Li ZG. Insulin, C-peptide, hyperglycemia, and central nervous system complications in diabetes. Eur J Phar-macol. 2004 Apr 19;490 (1-3): 187-197). Проявления ДЭ неспецифичны и наиболее часто указывают на преимущественную дисфункцию неспецифических срединных структур головного мозга. Диагностика ДЭ основывается, преимущественно, на клинической симптоматике, которая проявляется церебра-стеническими, цефалгическими, неврозоподобными, диэнцефальными нарушениями, пароксизмальными вегетативными кризами (Прихожан В.М. Поражение нервной системы при сахарном диабете. – М.: Медицина, 1981. – 295 с.).

Известна также определенная диагностическая ценность магнитно-резонансной томографии, позволяющей выявить фокальную кортикальную атрофию и снижение плотности серого вещества у больных СД (Manschot SM et al., 2006, Wessels AM, et al, 2006), однако данное исследование весьма дорогостоящее и регистрирует изменения в ЦНС уже на стадии органических необратимых изменений, которые в детском и подростковом возрасте еще не регистрируются.

Вопрос о диагностике субклинических форм ДЭ для проведения своевременной и адекватной превентивной коррекции с целью профилактики манифестации тяжелых ее проявлений весьма актуален. К наиболее значимым проявлениям ДЭ у взрослых лиц относятся проявления когнитивных расстройств в виде нарушения процессов запоминания и воспроизведения (Котов С.В., Калинин А.П., Рудакова И.Г. Диабетическая нейропатия. – М.: Медицина, 2000. – 228 с.), при этом у детей чаще отмечаются субклинические нарушения памяти и внимания, для выявления которых необходимо проведение соответствующего нейропсихологического тестирования (Northam EA, Anderson PJ, Jacobs R, Hughes М, Wame GL, Werther GA. Neuropsychological profiles of children with type 1 diabetes 6 years after disease onset. Diabetes Care. 2001 Sep; 24 (9): 1541-6), которое имеет возрастные ограничения (трудность выполнения инструкций и соблюдения методологии исследования у детей до 7 лет) и результаты которого могут зависеть от эмоционального состояния индивида и степени его мотивации. Поэтому существует необходимость разработки объективного метода ранней диагностики ДЭ у детей и подростков для выбора наиболее оптимальных программ лечения и мониторинга их эффективности.

В настоящее время для выявления диабетической энцефалопатии применяют метод вызванных потенциалов (ВП). Преимущественное поражение диэнцефальной области при СД подтверждается замедлением латентности V пика и длительности межпиковых интервалов III-V, I-V, снижением амплитуды V пика при исследовании коротколатентных слуховых вызванных потенциалов – КСВП (Bayazit Y, Yilmaz М, Kepekci Y, Mumbuc S, Kanlikama М. Use of the auditory brainstem response testing in the clinical evaluation of the patients with diabetes mellitus. J Neurol Sci. 2000 Dec 1; 181 (1-2): 29-32). Ограничениями данного способа являются наличие специализированного нейрофизиологического оборудования с компьютеризированной системой выделения и анализа характеристик, соответствующих ВП, недостаточная надежность вследствие возможности искажения характеристик ВП артефактами физического и физиологического происхождения, возрастные ограничения (трудность соблюдения методологии исследования у детей моложе 7 лет), индивидуальная вариабельность основных характеристик КСВП.

11. P.1840-1845. UNITED STATES).

Данный способ обладает целым рядом несовершенств: отличается недостаточной специфичностью, поскольку подобные изменения реактивности церебральных сосудов могут встречаться и при других патологических процессах в ЦНС, требует введения фармакопрепаратов, ограниченных к применению в детском возрасте.

Задача изобретения: разработка более точного, объективного способа ранней диагностики диабетической энцефалопатии у детей и подростков.

Поставленная цель достигается тем, что у ребенка с сахарным диабетом 1 типа с отсутствием клинико-неврологических церебральных нарушений проводят определение уровня S-100B (нг/л). У пациента с отсутствием церебральных дисфункций, выявляемых на основании традиционного клинико-неврологического осмотра, при уровне S-100B более в крови 140 нг/л диагностируют наличие субклинической диабетической энцефалопатии.

Технический результат от использования метода: повышение точности, снижение уровня погрешности, расширение возрастного диапазона обследуемых пациентов, что позволит своевременно провести соответствующие лечебные мероприятия и снизить или отсрочить тяжесть церебральных нарушений при сахарном диабете 1 типа у детей.

Нейроспецифический белок S-100B обнаружен у всех исследованных позвоночных и некоторых беспозвоночных. Белок S100B обнаруживается в астроцитах, олигодендроцитах, а также в эпендимальных, хориоидальных, эндотелиальных лимфоцитарных клетках человеческого мозга и некоторых нейронах (Steiner J, Bernstein HG, Bielau H, et al., Evidence for a wide extra-astrocytic distribution of S100B in human brain. BMC Neurosci. 2007 Jan 2; 8:2.) и находится в мозговой ткани в связанном с кальцием состоянии. Состоит из двух субъединиц, а (10,4 kDa) и b (10,5 kDa), освобождается в СМЖ после гибели нервных клеток. Белок S100B относится к семейству кальций-зависимых регуляторных протеинов, модулирующих активность белков, клеточных структур, а также участвующих в передаче сигнала. В нормальных количествах S-100B в мозге оказывает трофическое действие, защищая нейроны от воздействия оксидативного стресса и стимулируя рост нервных отростков, связываясь с рецепторами к КНПГ, а также стимулируя NF-kappaB комплекс, состоящий из р65 and c-Rel субъединицы. (Adami С, Bianchi R, Pula G, Donate R. S100B-stimulated NO production by BV-2 microglia is independent of RAGE transducing activity but dependent on RAGE extracellular domain. Biochim Biophys Acta. 2004 Dec 6; 1742 (1-3): 169-77). Астроциты играют важную роль в глутаматергической трансмиссии, при этом малые дозы S-100 В стимулируют обратный захват глутамата в культуре клеток гиппокампа, предохраняя нейроны от эксайтоксичного повреждения, усиливают нейрогенез в гиппокампе, способствуя улучшению когнитивных функций у подопытных крыс (Tramontina F, Tramontina AC, Souza DF, Leite MC, Gottfried C, Souza DO, Wofchuk ST, Goncalves CA. Glutamate uptake is stimulated by extracellular S100B in hippocampal astrocytes. Cell Mol Neurobiol. 2006 Feb; 26 (1): 81-6).

Однако астроциты и микроглия могут играть двоякую роль в отношении нейронов, как защищая их от повреждения через активацию нейротрофических факторов, так и индуцируя их дегенерацию через образование токсичных молекул (Reali С, Scintu F, Pillai R, Donato R, Michetti F, Sogos V. SlOOb counteracts effects of the neurotoxicant trimethyltin on astrocytes and microglia. J Neurosci Res. 2005 Sep 1; 81 (5): 677-86). S-100B может оказывать токсический (дозозависимый) эффект на культуру астроцитов, опосредуемый через активацию индуцибельной NO-синтазы, вызывая увеличение интенсивности и числа клеток, подвергающихся апоптозу в результате усиления образования под действием S-100B продуктов перекисного окисления и стресс-активированных киназ р38 и JNK. (Esposito G, De Filippis D, Cirillo С, Samelli G, Cuomo R, luvone T. The astroglial-derived SlOObeta protein stimulates the expression of nitric oxide synthase in rodent macrophages through р38 MAP kinase activation. Life Sci. 2006 May 1; 78 (23): 2707-15. Epub 2005 Dec 27. G. Esposito et al., 2005). Обнаруженные изменения его уровня при различной неврологической патологии – травмах, инсультах, болезни Альцгеймера, шизофрении, синдроме Туретта (M.A.Watson, M.G.Scott, 1995, S. Korfias, et al., 2006) – позволили отнести данный белок к разряду С-реактивных протеинов мозга и использовать его как биомаркер повреждения ЦНС подобно тому, как используют СРБ в качестве индикатора системного воспалительного процесса (Sen J, Belli A. S100B in neuropathologic states: the CRP of the brain? J Neurosci Res. 2007 May 15; 85 (7): 1373-80. Review). В эксперименте на животных показано, что сахарный диабет приводит к нарушению продукции и метаболизма S-100B в результате реактивного астроцитоза (Garcia-Espinosa МА, Garcia-Martin ML, Cerdiyn S Role of glial metabolism in diabetic encephalopathy as detected by high resolution 13 С NMR.NMR Biomed. 2003 Oct-Nov; 16 (6-7): 440-9). Таким образом, теоретические и экспериментальные предпосылки свидетельствуют о возможной роли белка S-100B не только как маркера реактивного глиоза в ЦНС, но и как фактора патогенеза гипоксического и дегенеративного процесса в мозге при сахарном диабете.

Эти выводы были подтверждены нашими исследованиями, выявившими прямую зависимость между выраженностью клинических и нейрофизиологических церебральных проявлений и уровнем белка S-100B в крови. Заявляемый способ исключает наличие субъективизма, не зависит от возраста, эмоционального статуса ребенка, не требует медикаментозного воздействия и позволяет врачу с высокой достоверностью по сывороточному уровню S-100B в крови выявить субклиническую форму ДЭ у пациента, страдающего сахарным диабетом 1 типа, и своевременно назначить наиболее адекватную патогенетическую терапию. Эта мера будет способствовать снижению риска развития тяжелых церебральных осложнений диабета, улучшению результатов обучения и социальной адаптации больных СД 1 типа. Уровень белка S 100В в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы CanAg S100 EIA (Швеция). Стандартные растворы, раствор конъюгата, меченного пероксидазой хрена, промывочный буфер готовят согласно инструкции к набору. Все лунки планшета, покрытые стрептавидином, однократно промывают промывочным буфером на вошере ELISA WASHER HUMAN (USA). В соответствующие лунки вносят по 50 мкл стандартов или по 50 мкл исследуемых проб. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора конъюгата моноклональных мышиных антител к белку S 100 с биотином и инкубируют 2 часа при комнатной температуре на шейкере ST3. По окончании инкубации промывают планшет трижды, как описано выше. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа. Проводят шестикратную промывку как описано выше. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ и инкубирут на шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут, защищая от прямых солнечных лучей. Останавливают цветную реакцию добавлением 100 мкл раствора 0,12 М соляной кислоты в каждую лунку. Измерение оптической плотности при 405 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Дания). В компьютерное обеспечение прибора вводят численные значения концентраций белка S 100В в стандартных растворах и получают после измерения концентрацию белка S-100B в опытных пробах. Выражают уровень белка S 100В в сыворотке крови пациента в нг/л. У ребенка с отсутствием церебральных дисфункций, выявляемых на основании традиционного клинико-неврологического осмотра, при уровне S-100B в крови более 140 нг/л диагностируют субклиническую стадию диабетической энцефалопатии.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1.

История болезни 5717. Пациентка Дарья И., 12 лет, болеет сахарным диабетом в течение 2 лет. Девочка от 1 беременности, протекавшей с угрозой прерывания, роды путем кесарева сечения, интранатальная гипоксия. В анамнезе отсутствовали указания на перенесенные черепно-мозговые травмы, нейроинфекции. Наследственность по СД не отягощена, клиническая манифестация заболевания произошла после психоэмоционального стресса. Тяжелых гипогликемии или кетоацидотических ком не отмечалось, течение СД можно было охарактеризовать как стабильное. Так средняя амплитуда колебаний натощаковой гликемии, измеренной в течение 3-х произвольно выбранных недель за предшествующий трехмесячный период по результатам дневника самоконтроля, составила 5,5 ммоль/л.

На момент обследования у ребенка было состояние компенсации СД, доза инсулина составила 1,0 ЕД/кг массы тела в сутки. Уровень гликозилированного гемоглобина 6,8%, холестерина 4,4 ммоль/л, (3-липопротеидов 38 ед., триглицеридов 0,8 ммоль/л. Щитовидная железа не увеличена, показатели тиреоидных гормонов в крови – в норме. АД 115/70 мм рт.ст.

Уровень S-100B в сыворотке крови составил 137 нг/л, что свидетельствовало об отсутствии субклинической диабетической энцефалопатии.

Неврологических нарушений у пациентки выявлено не было. В пробе на запоминание 10 слов отмечался нормальный объем кратковременной слухо-речевой памяти (9 баллов), отсутствие введения повторов и дополнительных слов при воспроизведении текста, нарастающий характер кривой запоминания.

По результатам исследования коротколатентных слуховых вызванных потенциалов у пациентки было подтверждено также отсутствие церебральных нейрофизиологических нарушений.

Пример 2.

История болезни 6168. Пациентка Елизавета К., 8 лет. Болеет сахарным диабетом 1 типа в течение года. Перинатальный анамнез отягощен, беременность протекала с угрозой прерывания, медикаментозное сохранение в сроке 8 и 24 нед., в родах – интранатальная асфиксия. Отсутствуют указания на перенесенные черепно-мозговые травмы, нейроинфекции. Наследственность по СД не отягощена, клиническая манифестация заболевания произошла после перенесенной острой энтеровирусной инфекции. Тяжелых гипогликемии или кетоацидотических ком у девочки не отмечалось. Течение заболевания было стабильным: уровень колебаний натощаковой гликемии, измеренной в течение 3-х произвольно выбранных недель за предшествующий трехмесячный период по результатам дневника самоконтроля, составил 5,8 ммоль/л.

На момент обследования у ребенка было достигнуто состояние компенсации СД, доза инсулина составила 0,8 ед/кг массы тела в сутки, уровень гликозилированного гемоглобина 7,1%, уровень холестерина 5,8 ммоль/л, Р-липопротеидов 54 ед., триглицеридов 0,6 ммоль/л. Щитовидная железа не увеличена, показатели тиреоидных гормонов в крови – в норме.

При традиционном клинико-неврологическом и нейропсихологическом обследовании нарушений со стороны ЦНС у пациентки выявлено не было.

Уровень S-100B в сыворотке крови составил 152,8 нг/л, что свидетельствовало о формировании субклинической диабетической энцефалопатии. При исследовании КСВП было выявлено уменьшение соотношения амплитуд пиков V/I с обеих сторон, что подтверждало наличие уменьшения амплитуды вызванного ответа со стороны мезэнцефальных структур мозга. Через год у девочки были отмечены клинические неврологические проявления в виде выраженных цефалгий, дисфорий, неадекватного поведения с чертами истероидности, демонстративности, лживости, что свидетельствовало о прогрессии церебральных проявлений в клиническую форму ДЭ.

Пример 3.

История болезни 3340. Пациент Игорь Г., 13 лет, болен сахарным диабетом в течение 7 лет. Перинатальный анамнез не отягощен, отсутствуют также указания на перенесенные черепно-мозговые травмы, нейроинфекции. Наследственность по СД не отягощена, клиническая манифестация заболевания произошла без видимой провоцирующей причины. Тяжелых гипогликемии или кетоацидотических ком у мальчика не отмечалось, течение СД можно было охарактеризовать как стабильное. Метаболический контроль СД можно было признать удовлетворительным, так как уровень гликозилированного гемоглобина составлял к моменту обследования 6,7%. Уровень колебаний натощаковой гликемии, измеренной в течение 3-х произвольно выбранных недель за предшествующий трехмесячный период по результатам дневника самоконтроля, составил 4,5 ммоль/л. При клинико-неврологическом обследовании и нейропсихологическом обследовании нарушений со стороны ЦНС у пациента выявлено не было.

На момент обследования у пациента было достигнуто состояние компенсации СД, доза инсулина составила 0,95 ЕД/кг массы тела в сутки, уровень холестерина 5,8 ммоль/л, Р-липопротеидов 46 ед., триглицеридов 0,8 ммоль/л. Щитовидная железа не увеличена, показатели тиреоидных гормонов в крови – в норме.

Уровень S-100B в сыворотке крови составил 160,5 нг/л, что свидетельствовало о наличии субклинической диабетической энцефалопатии.

В ходе исследования коротколатентных слуховых вызванных потенциалов у пациента были выявлены удлинение длительности интервала I-V и уменьшение соотношения амплитуд V/I с левой стороны при контралатеральной стимуляции, что свидетельствовало о нарушениях проведения и снижении амплитуды ответа на слуховой стимул со стороны мезэнцефальных структур мозга. Через год у пациента появились признаки начальной ДЭ в виде введения нескольких повторяющихся и дополнительных слов при воспроизведении пробы на запоминание 10 слов, угасающего характера кривой запоминания.

По заявляемому способу обследовано 29 пациентов с сахарным диабетом и отсутствием клинических проявлений церебральных нарушений в возрасте от 7 до 16 лет с длительностью СД от 1 года до 10 лет. В группе пациентов с уровнем S-100B в сыворотке крови более 140 нг/л (n=17), наличие нейрофизиологических изменений, свидетельствующих о субклинической форме ДЭ, было зафиксировано у 14 чел. (82,3%). В группе пациентов с уровнем S-100B в сыворотке крови менее 140 нг/л (n=12), наличие нейрофизиологических изменений, свидетельствующих о субклинической форме ДЭ, было зафиксировано у 2 чел. (16,7%), р=0,007.

Таким образом, исследование уровня S-100B в сыворотке крови у детей и подростков с СД показало, что он является высокоинформативным и объективным критерием степени тяжести клинической ДЭ и высокоточным диагностическим маркером субклинической формы ДЭ. Точность заявляемого способа достигает 82,3%

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ диагностики диабетической энцефалопатии у детей по сравнению с существующими имеет следующие преимущества:

1. Способ позволяет осуществить раннюю диагностику ДЭ с целью выбора своевременного превентивного лечения.

2. Данный способ объективен, не зависит от возраста, мотивации и эмоционального статуса пациента, не требует медикаментозного вмешательства.

3. Предлагаемый способ обладает достаточно высокой точностью, прост в исполнении и найдет широкое применение в эндокринологической и нейродиабетологической практике.

Формула изобретения

Способ ранней диагностики диабетической энцефалопатии у детей, отличающийся тем, что у больного сахарным диабетом, не имеющего клинических проявлений церебральных нарушений, в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа уровень белка S-100B и при повышении его уровня более 140 нг/л диагностируют субклиническую стадию диабетической энцефалопатии.