Патент на изобретение №2388822

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности. Пищевую карбоксиметилцеллюлозу растворяют в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10 и добавляют к фильтрату полученного раствора целлюлазу, продуцируемую культурой Trichoderma reesei или культурой Trichoderma viride с активностью не ниже 50 ед/г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин. Образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5 и оставляют на сутки в холодильнике. Выпавшие частицы отделяют из раствора и неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие целлюлазу, отделяют и высушивают. Это позволяет уменьшить размер частиц иммобилизованной целлюлазы, что способствует увеличению скорости ферментативного процесса.

Изобретение относится к нанотехнологиям и может быть использовано в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве.

Известны разные методы иммобилизации различных ферментов, включая целлюлазу (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Экологические основы биотехнологии. М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2006, С.164 – 180).

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ получения иммобилизованной гемицеллюлазы, предусматривающий смешивание раствора гемицеллюлазы с активированным n-бензохином силохромом в среде 0,1 М ацетатного буфера с рН 4-5 (см. SU 1055770 A1, 23.11.1983).

Основным недостатком всех этих способов является использование в качестве носителя синтетических полимеров, которые невозможно применять в пищевой и медицинской промышленности. Размер частиц получаемых иммобилизованных ферментов довольно велик (обычно составляет 100-200 мкм), что не позволяет применять их в медицинской практике.

Задача, решаемая данным изобретением, заключается в получении иммобилизованной целлюлазы на пищевой карбоксиметилцеллюлозе – носителе природного типа. Заявляемое техническое решение дает возможность получать частицы иммобилизованной целлюлазы размером в тысячи раз меньше. Химические процессы, в которых участвуют ферменты, протекают на межфазных поверхностях раствор – субстрат (целлюлоза), при этом фермент адсорбируется на поверхности субстрата. Уменьшение размеров частиц иммобилизованного фермента (целлюлазы) резко увеличивает его доступность в сферу реакции, следовательно, увеличивает скорость ферментативного процесса, а часто и возможность осуществления самого процесса. Применение пищевой карбоксиметилцеллюлозы для получения иммобилизованной целлюлазы в заявленном техническом решении позволяет получать на их основе биодобавки, биокатализаторы для самых различных целей, включая пищевую промышленность, медицину и сельское хозяйство.

Техническая сущность заявленного решения заключается в получении иммобилизованной целлюлазы на природном носителе карбоксиметилцеллюлозе, использование которой позволяет проводить ферментативные реакции с большими скоростями не только в растворах, но и на твердых субстратах, что является важным при их использовании в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве.

Для выполнения поставленной задачи используется способ получения иммобилизованной целлюлазы, заключающийся в растворении носителя в подщелоченной дистиллированной воде или растворе порошка фермента с активностью не ниже 50 ед/г, в качестве носителя используют пищевую карбоксиметилцеллюлозу, в качестве фермента целлюлазу, продуцируемую культурой T.reesei или T.viridae в виде порошка, иммобилизацию проводят в буферном растворе или в подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10 в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, в течение 60 мин, после чего охлаждают образовавшуюся эмульсию до 5-10°С, рН реакционной смеси уменьшают до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, выпавшие частицы целлюлазы отделяют от раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы отделяют и высушивают.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. 10 г пищевой карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) добавляют к 50 мл боратного буфера, имеющего рН 9,5 и реакционную смесь перемешивают до максимального растворения КМЦ. Полученный раствор фильтруют и добавляют к фильтрату 1 г целлюлазы, выделенной из культуры T.reesei с активностью 60 ед/г и 5 мл 1,5%-ного раствора ПАВ, например твин 40. Раствор интенсивно перемешивают при помощи вибротуракса со скоростью 4500-5000 об/мин в течение 60 мин и образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, после чего подкисляют ее соляной кислотой до значения рН 3,0-3,5. Эмульсию помещают на сутки в холодильник, через каждые 3-3,5 часа снова подвергают всю смесь перемешиванию при помощи вибротуракса. Спустя сутки, раствор вновь перемешивают при помощи вибротуракса. Полученные частицы отделяют от реакционной массы центрифугированием со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего отделившийся раствор сливают, а к оставшимся частицам добавляют по 10 мл ацетатного буфера с рН 4-4,5. Операцию повторяют 2-3 раза, каждый раз подвергая реакционную массу перемешиванию вибротураксом. После этого раствор снова центрифугируют. Оставшуюся массу переносят в колбы или пенициллиновые флаконы по 1 мл во флакон и высушивают на сублимационной сушилке. Выход полученных частиц составляет 80%, активность нейтральной целлюлазы составляет 40-42 ед/г, размер полученных частиц иммобилизованной целлюлазы равен 250-260 нм.

Пример 2. Опыт проводят аналогично примеру 1, но вместо буфера используют подщелоченную дистиллированную воду, в качестве фермента берут целлюлазу, выделенную из культуры T.viridae с целлюлазной активностью 100 ед/г, в качестве ПАВ 1 мл 1%-ного раствора твин 20. Выход частиц вместе с включенным в них ферментом составляет 75%, активность целлюлаз составляет 89-90 ед/г, размер частиц иммобилизованной целлюлазы равен 260-270 нм.

Пример 3. Опыт проводят аналогично примеру 1, но в качестве фермента используют смесь целлюлаз обоих видов, взятых в соотношении 1:1, а в качестве ПАВ Спан-85. Выход частиц составляет 80%, активность – 90 ед/г, размер частиц иммобилизованной целлюлазы равен 280-300 нм.

Таким образом, изобретение позволяет получать иммобилизованные целлюлазы, которые могут быть с успехом использованы в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной целлюлазы, заключающийся в растворении пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавлении к фильтрату полученного раствора целлюлазы, продуцируемой культурой Trichoderma reesei или культурой Trichoderma viride с активностью не ниже 50 ед/г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие целлюлазу, отделяют и высушивают.