Патент на изобретение №2388821

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химической и микробиологической промышленности. Способ предусматривает измельчение поджелудочной железы. Измельченную поджелудочную железу обрабатывают раствором хлорида натрия 4,5-6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа:раствор соли 1:(1,5-2,0) при температуре 25-35°С в течение 2,5-3,5 ч. Полученные клетки поджелудочной железы отделяют центрифугированием и обрабатывают 95% этиловым спиртом в течение 15-24 ч в объемном соотношении 1:(0,85-1,3) при температуре 15-25°С. Отделяют клетки поджелудочной железы центрифугированием с последующей обработкой этих клеток водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0-3,0, в течение 2,5-4,5 ч при температуре 25-35°С в объемном соотношении 1:(0,8:1,2). Полученные клетки поджелудочной железы отделяют центрифугированием с получением супернатанта. Из полученного супернатанта экстрагируют рибонуклеазу растворами серной кислоты с концентрацией 0,15-0,35 н. в течение 3-4 ч при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4-6°С. Отделяют взвешенные частицы центрифугированием с получением экстракта, содержащего рибонуклеазу. Полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией. Полученный концентрат охлаждают до 4-6°С и осаждают рибонуклеазу при pH 8,0-9,0. Полученный осадок промывают этиловым спиртом в объемном соотношении 1:5 и сушат. Изобретение позволяет повысить выход фермента. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству ферментов, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Известен способ получения рибонуклеазы (РНК-азы) [Kunitz M., J. Gen. Physiol, 24, 15 (1940); McDonald M.R., Methods in enzymology, Vol.2, p.427 (S.P.Colowick and N.O.Kaplan, Eds.), New York. Academic Press (1955)] путем экстрагирования из свежей бычьей поджелудочной железы 0,25 н. раствором серной кислоты в объемном отношении 1:2 в течение 24 ч с последующим осаждением из экстракта трипсиногена, химотрипсиногена и дезоксирибонуклеазы сернокислым аммонием при 0,6 насыщении, затем при 0,8÷0,85 насыщения фракционируют РНК-азу. Выделенный таким способом фермент обычно загрязнен следовыми количествами протеолитических ферментов. Очистку [Тугунов С.С., Константинов В.Л. и др. Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратов ферментов трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы из панкреатической железы / Труды Ленинградского химико-фармацевтического института, 1967, вып.20, с.9-18] производственного высола РНК-азы осуществляют повторным переосаждением сульфатом аммония. Обезвоживание осадка РНК-азы проводят этанолом. Сушку кристаллов РНК-азы проводят под вакуумом при температуре 50°С. Выход препарата, по предлагаемой технологии, составляет 0,1% от массы сухой поджелудочной железы. Недостатками данного способа выделения панкреатической РНК-азы являются низкий выход продукта из-за многостадийности процесса, длительность проведения, низкая степень осаждения РНК-азы вследствие ее малой концентрации в растворе.

Известен способ получения панкреатической РНК-азы из поджелудочной железы крупного рогатого скота [Пат. RU 2180918 C1, МПК⁷ C12N 9/22. Способ получения панкреатической рибонуклеазы. Дата публикации: 27.03.2002. Изобретатель: Красноштанова А.А., Баурина М.М., Кашкина Е.А., Крылов И.А. Патентообладатель: Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева]. Для увеличения выхода препарата была предложена следующая схема выделения. Фермент выделяется путем экстракции 0,25 н. раствором серной кислотой в отношении 1:2 в течение 24 ч. После отделения взвешенных частиц центрифугированием супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ 450 с диаметром пор 450 Å при давлении 0,2 МПа. Пермеат, полученный на данной стадии, используется при повторной экстракции. Осаждение проводят при pH среды 7,8÷8,0. Осадок технической РНК-азы растворяют в дистиллированной воде и раствор нагревают до температуры 85÷90°С с последующим выдерживанием 10 мин. После этого повторно осаждают РНК-азу при pH среды 7,8÷8,0. Выпавшие кристаллы очищенной РНК-азы промывают этанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают таким способом 1,2 г РНК-азы с 1 кг ПЖ с активностью 12000-14000 ед./мл. Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,6% от массы сухой поджелудочной железы.

Указанный способ обладает рядом недостатков, главным из которых является длительность процесса очистки – нагрев, выдержка и охлаждение занимает 30 мин, данная стадия заметно ухудшает качество препарата – в очищенном препарате содержится около 30% примесных инактивируемых белков, при этом выход препарата не превышает 0,6% от массы сухой поджелудочной железы.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода панкреатической РНК-азы в условиях комплексной переработки поджелудочной железы, с предварительным извлечением ферментов пищеварительной группы, таких как амилаза, липаза и комплекс протеаз.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ извлечения панкреатической рибонуклеазы из поджелудочной железы, предусматривающий измельчение, обработку измельченной поджелудочной железы раствором хлорида натрия 4,5÷6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа:раствор соли 1:(1,5÷2,0) при температуре 25÷35°С в течение 2,5÷3,5 ч, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы 95% этиловым спиртом в течение 15÷24 ч в объемном соотношении 1:(0,85÷1,3) при температуре 15÷25°С, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием; обработку клеток поджелудочной железы водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0÷3,0, в течение 2,5÷4,5 ч при температуре 25÷35°С в объемном соотношении 1:(0,8÷1,2), отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, экстракцию рибонуклеазы растворами серной кислоты с концентрацией 0,15÷0,35 н. в течение 3÷4 часов при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4÷6°С, отделение взвешенных частиц центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией, охлаждение экстракта до 4÷6°С, осаждение фермента при pH 8,0÷9,0, промывку полученного экстракта этиловым спиртом в объемном соотношении 1:5 и сушку. В отличие от прототипа, в данном способе выделения сокращается время экстракции РНК-азы из клеток ПЖ, а также не нужно проводить инактивацию белков, обладающих протеазной и ДНК-азной активностью, так как получаемый экстракт не содержит данных ферментов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 1000 г (250 г по абсолютно сухому веществу) измельченной поджелудочной железы обрабатывают раствором хлорида натрия 4,5 мас.% (объемное соотношение поджелудочная железа:раствор соли 1:1,5), в течение 2,5 ч при температуре 25°С, клетки ПЖ отделяют центрифугированием. Получают супернатант, содержащий амилазу 29,6 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 770 г, 167 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают 95% этиловым спиртом в течение 15 ч в объемном соотношении 1:0,85 при температуре 15°С, клетки ПЖ отделяют центрифугированием. Получают супернатант, содержащий липазу 8,77 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 400 г, 87 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0, в течение 2,5 часов, объемном соотношении 1:0,8 при температуре 25°С. Получают супернатант, содержащий комплекс протеаз 1252 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 350 г, 72 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают раствором серной кислоты с концентрацией 0,15 н. в течение 3 ч при температуре 4°С (объемное соотношение 1:0,8). Взвешенные частицы отделяют центрифугированием, в результате получают супернатант с активностью РНК-азы 100 ед./мл. Супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ 10 с отсечкой 10 кДа при давлении 0,2÷0,4 МПа. Получаемый на данном этапе пермеат используют повторно на стадии экстракции, ультраконцентрат с активностью РНК-азы 2100 ед./мл подвергают дополнительной очистке с использованием диафильтрации. После этого концентрат охлаждают до температуры 4÷6°С и доводят значение pH среды до 8,0÷9,0. Осадок РНК-азы перекристаллизовывают этиловым спиртом в отношении 1:5. Полученные очищенные кристаллы РНК-азы высушивают в вакуум-сушильном шкафу. В результате получают 0,75 г рибонуклеазы с активностью 12000-14000 ед./мг. Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,3% от массы сухих веществ исходной поджелудочной железы и 1,04% от массы сухих веществ на стадии.

Условия проведения предварительной обработки ПЖ и экстракции РНК-азы сведены в таблицу.

При осуществлении данного способа выделения РНК-азы из ПЖ происходит увеличение выхода ферментного препарата на стадии выделения РНК-азы в 1,3÷1,7 раза по сравнению с аналогом, при этом активность ферментного препарата РНК-азы не понижается. Также упрощается технологическая схема за счет исключения из технологического процесса стадий очистки ферментного препарата от примесных гидролаз и сокращения времени экстракции.

Проведенный расчет технико-экономических показателей получения РНК-азы по прототипу (в индивидуальном производстве) и в комплексном производстве показал, что в первом случае себестоимость 1 г фермента составляет 110 руб., а при комплексной переработке – 13 руб. Таким образом, при организации комплексного производства себестоимость препарата снижается в 8,5 раз, а срок окупаемости дополнительных капитальных вложений не превышает 1,5 года.

Формула изобретения

Способ получения панкреатической рибонуклеазы из поджелудочной железы, предусматривающий измельчение, обработку измельченной поджелудочной железы раствором хлорида натрия 4,5÷6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа : раствор соли 1 : (1,5÷2,0) при температуре 25÷35°С в течение 2,5÷3,5 ч, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы 95%-ным этиловым спиртом в течение 15÷24 ч в объемном соотношении 1 : (0,85÷1,3) при температуре 15÷25°С, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0÷3,0 в течение 2,5÷4,5 ч при температуре 25÷35°С в объемном соотношении 1 : (0,8÷1,2), отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, экстракцию рибонуклеазы растворами серной кислоты с концентрацией 0,15÷0,35 н. в течение 3÷4 ч при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4÷6°С, отделение взвешенных частиц центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией, охлаждение экстракта до 4÷6°С, осаждение фермента при pH 8,0÷9,0, промывку полученного экстракта этиловым спиртом в объемном соотношении 1 : 5 и сушку.