Патент на изобретение №2388820

(54) ГЕН ABFB-2 PENICILLIUM FUNICULOSUM

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид, обладающий -L-арабинофуранозидазной активностью, выбранный из следующих полипептидов: полипептид с SEQ ID No.2, полипептид, аминокислотная последовательность которого находится между положениями 28 и 400 SEQ ID No.2, фрагмент полипептида с SEQ ID No.2, обладающий активностью -L-арабинофуранозидазы, полипептид, обладающий активностью -L-арабинофуранозидазы В и проявляющий, по меньшей мере, 80% идентичность с полипептидом SEQ ID No.2. Изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему данный полипептид, экспрессионной кассете и вектору, содержащим полинуклеотид, и организму-хозяину, содержащему данный полипептид. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для гидролиза -L-арабинофуранозильных связей в арабинофуранозилолигосахаридных соединениях. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил, 2 табл.

Настоящее изобретение относится r гену abfB-2, выделенному из Penicillium funiculosum и полипептиду ABFB-2, кодируемому этим геном и обладающему активностью -L-арабинофуранозидазы В.

Penicillium funiculosum представляет собой таларомицет семейства Aspergilleae. Выделение этого микроорганизма из множества органических субстратов, подверженных воздушному или водному загрязнению, указывает на то, что этот грибок обладает удивительно богатым арсеналом гидролитических ферментов. Применение этой ферментной смеси в питании животных способствует деполимеризации природных органических субстратов и позволяет улучшить их перевариваемость. Так, в заявке WO 99/57325 описывается штамм Penicillium funiculosum, обозначаемый IMI378536, который вырабатывает ферментную смесь, пригодную, в частности, для применения в питании животных. Тем не менее, такие ферментные смеси, вырабатываемые Penicillium funiculosum, охарактеризованы биохимически в недостаточной степени. В действительности, для полученных ферментационных сред охарактеризовано только ограниченное количество ферментов, таких как ксиланаза и -глюканаза. Эти активности отражают лишь часть совокупности ферментов, присутствующих в смеси.

Соединения типа гемицеллюлоз сельскохозяйственного происхождения составляют, вслед за целлюлозой, второй по значимости резерв полисахаридов в составе растительных тканей. Эта группа характеризуется широким спектром гетерополисахаридов, основными представителями которых являются ксиланы, арабинаны, галактаны, глюканы и маннаны. Арабиноза в фурфурольной форме широко представлена среди таких гетерополисахаридов, как арабинаны и арабиноксиланы. Арабинан представляет собой полимер из остатков арабинофуранозы, соединенных связями -1-5, который может быть замещен в положении O-2 или O-3 одним или двумя остатками арабинозы. Что же касается арабиноксиланов, -L-арабинофуранозильные остатки соединяются с основной -1-4-ксилопиранозильной цепью связями -1-3 и -1-2. Присутствие остатков арабинозы в этих боковых цепях может препятствовать ферментативному гидролизу гемицеллюлозных соединений при разного рода промышленных применениях, например, при улучшении перевариваемости кормов для животных. Ферменты, расщепляющие -L-арабинофуранозидные связи, могут действовать синергично с ксиланазами, позволяя проходить гидролизу арабиноксиланов и арабинанов.

Таким образом, арабиназные активности (эндо-, экзоарабиназной и, в большинстве своем, -L-арабинофуранозидазные активности) могут действенным образом, синергично с ксиланазами, вносить свой вклад в деполимеризацию гемицеллюлозных соединений. Гемицеллюлозные и пектиновые соединения могут составлять до 50% общего количества углеводов в растительном сырье и представляют собой главный источник энергии для животных. Улучшение перевариваемости этих соединений связано с уменьшением степени замещения арабинозильными остатками гемицеллюлозных соединений (Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101:93-100).

Ферменты, гидролизующие связи между остатками L-арабинозы, выделены из таких микроорганизмов, как бактерии и нитчатые грибы. Такие арабинозидазы в основном представлены -L-арабинофуранозидазами (ЕС 3.2.1.55), способными гидролизовать невосстанавливающие -L-арабинофуранозильные остатки, происходящие из L-арабиноксиланов или таких соединений, как арабинаны и арабиногалактаны.

-L-арабинофуранозидазы (ЕС 3.2.1.55) разделены на два семейства гликозидгидролаз (GH 51 и GH 54) по сходству аминокислотной последовательности. Эти два семейства различаются по специфичности к полисахаридному субстрату. В первой группе (GH 51) представлены арабинофуранозидазы типа А, действующие только на короткие линейные структуры арабинофуранозильных олигосахаридов, имеющих -1-5 связи. Во вторую группу входят арабинофуранозидазы типа В (GH 54), катализирующие гидролиз связей -1-5, -1-3 и -1-2 боковых цепей арабинофуранозилолигосахаридов.

Арабинофуранозидазы В (ABFB) были выделены из множества бактерий, а также из нитчатых грибов. Род Aspergillus здесь представлен в наибольшей степени, однако этот фермент выделяли и из представителей родов Trichoderma, Penicillium, и Fusarium.

В WO 96/29416, WO 96/06935, и US 5,989,887 описываются гены арабинофуранозидазы Aspergillus niger.

Гилькенс и др. (Gielkens et al. – Microbiology, 145, 735-741, 1999) описали ген abfB Aspergillus nidulans.

В WO 96/29416, WO 96/06935, WO 2004/018662 и US 5,989,887 описываются гены арабинофуранозидазы Aspergillus niger. Выравнивание аминокислотных последовательностей указывает на то, что белок abfB А. niger на 50,9% идентичен белку ABFB-2 P. funiculosum. В этих патентных заявках не описано ни одной характеристики, существенной для применения полипептида в питании животных.

Описаны (Clinche et al. – J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383, 1997) три -L-арабинофуранозидазы из Aspergillus terreus, потенциально применимые в виноделии.

Гены abfB Aspergillus kawachii и Aspergillus awamori были описаны Косеки и др. (Koseki et al. -J. of Bioscience and Bioengineering, vol. 96, no. 3, 232-241, 2003). Эти ферменты находят применение для сбраживания японского ликера сечу.

Описан также ген abfB нитчатого грибка Trichoderma reesei (Margolles-Clark et al. – Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846, 1996).

Кроме того, описаны две внеклеточные -L-арабинофуранозидазы из Fusarium oxysporum (Panagiotou et al. – Can J 10 Microbiol. 2003: 49(10):639-4).

Карвальо и др. (Carvallo et al. – Mycol. Res., 107 (4), 388-394, 2003) описывают -L-арабинофуранозидазу В из Penicillium purpurogenum. Выравнивание аминокислотных последовательностей говорит о том, что белок abf-1 P. purpurogenum на 51,2% идентичен белку ABFB-2 Р. funiculosum. В этой статье не описано ни одной характеристики, существенной для применения этого полипептида в питании животных.

Сакамото и др. (Sakamoto ef al – FEBS Letters 560, 199-204, 2004) описывают ген abnx Penicillium chrysogenum, кодирующий фермент с арабиназной активностью, отличной, однако, от таковой ABFB.

Тем не менее, эти ферменты ABFB не обладают оптимальными свойствами, необходимыми для применения в питании животных.

В самом деле, для применения в питании животных ABFB должны обладать свойствами, совместимыми с условиями обработки, которой подвергаются корма, предназначенные для питания. В частности, активность используемых ферментов должна быть устойчива при температурах и условиях рН, при которых обрабатываются корма, и, по возможности, являться оптимальной как для приготовления кормов, так и при условиях, имеющих место в пищеварительной системе животных, поедающих эти корма.

Сверх того, эти ферменты должны обладать широким спектром действия на различные гетерополисахариды (арабинаны, арабиноксиланы и арабиногалактаны) в отношении снижения разветвленности для обеспечения эффективного улучшения перевариваемости кормов животными. Такое улучшение перевариваемости кормов позволяет повысить их питательную ценность. Таким образом, ферменты, обладающие улучшенными показателями специфичности (стереоспецифичность, энантиослективность), активности или сродства по отношению к природным субстратам (арабиноксиланам и арабинанам), представляют большой интерес в области питания животных.

Кроме того, перед гидролизом арабинофуранозильных связей строго необходимо прежде деполимеризовать сложные молекулы, такие как целлюлоза. Целлюлозолитические ферменты (целлюлазы) грибов обыкновенно содержат домен fCBD (домен связывания целлюлозы грибного типа – fungal cellulose binding domain), который играет решающую роль в деполимеризации целлюлозы.

Настоящее изобретение описывает -L-арабинофуранозидазу В (ABFB-2) Penicillium funiculosum, подходящую для применения в питании животных, а также ген, кодирующий этот фермент. Настоящее изобретение касается также гомологов, вариантов и фрагментов ABFB-2, обладающих теми же каталитическими свойствами.

Ферменты ABFB, соответствующие настоящему изобретению, предпочтительно отличаются тем, что имеют очень кислый рН-оптимум (рН 2,6) и сохраняют 55% своей активности при рН 1,5.

Кроме того, предпочтительно фермент ABFB2 содержит домен связывания целлюлозы грибного типа (fCBD). Домен такого типа описан в других ферментах, но никогда ранее не был описан для арабинофуранозидаз грибов. Функциональную активность этого домена связывания целлюлозы в составе фермента ABFB2 Penicillum funiculosum оказалось возможным проверить экспериментально. Присутствие этого домена связывания повышает сродство фермента к своему субстрату и вследствие этого позволяет улучшить деградацию нерастворимой целлюлозы.

Таким образом, благодаря своим каталитическим свойствам и своему сродству к целлюлозе ABFB-2 Penicillium funiculosum особо пригоден к применению, в частности, в питании животных.

Однако ферменты, соответствующие настоящему изобретению, имеют и другие промышленные и агропромышленные применения. Отметим, в частности, обработку фруктовых соков, производство бумаги, превращение гемицеллюлозных биомасс в топливо или химические продукты, производство алкогольных продуктов сбраживанием.

Описание последовательностей

SEQ ID No.1: Геномная последовательность гена abfB-2 Penicillium funiculosum.

SEO ID No.2: Аминокислотная последовательность полипептида ABFB-2 Penicillium funiculosum, обладающего -L-арабинофуранозидазной активностью типа В.

SEO ID No.3: Домен fCBD ABFB-2 Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.4: Домен низкой сложности ABFB-2 Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.5: Домен fCBD цианомилэстеразы Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.6: Домен fCBD эндо-1-4-D-ксиланазы Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.7: Домен fCBD ксиланазы целлобиогидролазы Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.8: ПЦР праймер XbaI-abfB-2.

SEQ ID No.9: ПЦР праймер HindIII-abfB-2.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептиду, включающему полипептид, выбираемый из следующих полипептидов:

– полипептид SEQ ID No.2,

– полипептид, аминокислотная последовательность которого находится между положениями 28 и 400 SEQ ID No.2,

– фрагмент полипептида SEQ ID No.2, обладающий активностью -L-арабинофуранозидазы В,

– полипептид, обладающий активностью -L-арабинофуранозидазы В, и являющийся идентичным полипептиду SEQ ID No.2, по меньшей мере, на 80%.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему активность -L-арабинофуранозидазы В, выбираемому из числа следующих полинуклеотидов:

– полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого находится между положениями 268 и 1470 SEQ ID No.1,

– полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого находится между положениями 349 и 1470 SEQ ID No.1,

– полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1 формулы изобретения.

Другим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, обладающий последовательностью, представленной SEQ ID No.1, или последовательностью, комплементарной SEQ ID No.1.

Настоящее изобретение касается также экспрессионных кассет, в которых в направлении транскрипции расположены:

– промотор, являющийся функциональным в организме хозяина;

– полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению, и

– терминатор, являющийся функциональным в организме того же хозяина.

Другим объектом настоящего изобретения является вектор, содержащий полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению, и/или экспрессионую кассету, соответствующую настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, соответствующим настоящему изобретению, экспрессионной кассетой, соответствующей настоящему изобретению, и/или вектором, соответствующим настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения организм-хозяин выбирают среди дрожжей и нитчатых грибов.

Предпочтительно организмом-хозяином является штамм Penicillium funiculosum.

Настоящее изобретение также относится к кормовой добавке для животных, содержащей полипептид, соответствующий настоящему изобретению, организм-хозяин, соответствующий настоящему изобретению, или ферментационную среду из организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению.

Предпочтительно эта кормовая добавка представлена в виде жидкости или в виде порошка.

Другим аспектом настоящего изобретения является корм для животных, содержащий основу питания животных и кормовую добавку для животных, соответствующую настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к применению полипептида ABFB, соответствующего настоящему изобретению, или организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению, для производства кормовой добавки для животных или корма для животных.

Другим объектом настоящего изобретения является применение полипептида ABFB, соответствующего настоящему изобретению, или организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению, для гидролиза -L-арабинофуранозильных связей в арабинофуранозилолигосахаридах.

Полипептиды

Итак, настоящее изобретение относится к полипептидам ABFB, обладающим активностью -L-арабинофуранозы В. Предпочтительно эти полипептиды выделены из Penicillium funiculosum.

Выражение “-L-арабинофуранозидаза В” следует понимать как -L-арабинофуранозидазы (ЕС 3.2.1.55) типа В (GH 54), которые катализируют гидролиз связей -1,5; -1,3 и -1,2 боковых цепей, содержащихся в арабинофуранозилолигосахаридных соединениях.

Полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, пригодны для применения в питании животных.

Выражение “полипептид, пригодный для применения в питании животных” следует понимать как полипептид, свойства которого таковы, что он подходит для питания животных. Характеристиками, существенными для применения в питании животных, в частности, являются рН и температура, при которых тот или иной фермент активен. В самом деле, рН в пищеварительной системе животных является кислым, и, следовательно, для сохранения активности фермента в отношении гидролиза по остаткам L-арабинозы, важно, чтобы фермент оставался активным при таком рН. Кроме того, применение в кормовой добавке или в корме для животных подразумевает обработку добавки или корма в процессе приготовления и нахождение при температуре выше температуры окружающей среды. Активность применяемых при этом ферментов должна быть устойчива к условиям обработки, в частности, к соответствующим температурным условиям.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения полипептид проявляет -L-арабинофуранозидазную активность при кислом рН, например, менее 4,5, предпочтительно, менее 4. Кроме того, в соответствии с одним из осуществлений настоящего изобретения, оптимум -L-арабинофуранозидазной активности у рассматриваемого полипептида лежит в области рН от 1,5 до 3,5.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения полипептид проявляет -L-арабинофуранозидазную активность при температурах, превышающих температуру окружающей среды. Предпочтительно температурный оптимум -L-арабинофуранозидазной активности для полипептида, соответствующего настоящему изобретению, лежит в области от 30°С до 70°С, более предпочтительно, от 40 до 60°С.

-L-арабинофуранозидаза В штамма IMI378536 Penicillium funiculosum представлена последовательностью SEQ ID No. 2.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, являются гликозилированными. Полипептид, соответствующий SEQ ID No.2, в частности, несет участки N-гликозилирования по аминокислотому остатку 123 и аминокислотному остатку 127. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления остатки аспарагина в положениях 123 и 127 в составе полипептида, соответствующего SEQ ID No.2, являются гикозилированными.

-L-арабинофуранозидаза В Penicillium funiculosum представляет собой фермент, секретируемый грибком во внеклеточную среду. Поэтому полипептид SEQ ID No.2 содержит сигнальный полипептид из 27 амиокислотных остатков. Объектом настоящего изобретения является и зрелый полипептид, образующийся после отщепления сигнального пептида. В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого находится между положением 28 и положением 400 SEQ ID No.2. В соответствии с другим вариантом осуществления сигнальный пептид полипептида SEQ ID No.2 может быть заменен гетерологичным сигнальным пептидом для экспрессии и секреции полипептида SEQ ID No.2 чужеродным организмом-хозяином.

Настоящее изобретение также относится к фрагментам полипептида SEQ ID No.2, обладающих активностью -L-арабинофуранозидазы В.

Термин “фрагмент” полипептида обозначает полипептид, включающий часть полипептида, производным которого он является, но не весь целиком. Настоящее изобретение, таким образом, относится к полипептиду, содержащему фрагмент полипептида SEQ ID No.2 длиной 100, 200 или 300 аминокислотных остатков.

Такой фрагмент полипептида SEQ ID No.2 сохраняет -L-арабинофуранозидазную активность. Таким образом, настоящее изобретение относится биологически активным фрагментам полипептида SEQ ID No.2. Термин “биологически активный фрагмент” обозначает фрагмент полипептида, сохраняющий функцию полипептида, от которого он происходит. Биологически активные фрагменты полипептида SEQ ID No.2, таким образом, сохраняют функцию полипептида ABFB-2 Penicillium funiculosum. Эти биологически активные фрагменты обладают активностью -L-арабинофуранозидазы В. Фрагменты ABFB, соответствующие настоящему изобретению, предпочтительно содержат домен связывания целлюлозы. В предпочтительном варианте осуществления домен связывания целлюлозы имеет последовательность, описываемую SEQ ID No. 3. Предпочтительно такие фрагменты проявляют максимальную -L-арабинофуранозидазную активность при рН 2,6.

Способы приготовления фрагментов полипептида, а также методики измерения активности -L-арабинофуранозидазы В хорошо известны специалистам.

Объектом настоящего изобретения также являются полипептиды, проявляющие активность L-арабинофуранозидазы В и обладающие, по меньшей мере, 90%-ной идентичностью с полипептидом SEQ ID No.2. Предпочтительно, эти полипептиды обладают теми же свойствами и, в частности, теми же каталитическими свойствами, что и полипептиды SEQ ID No.2. Предпочтительно, такие полипептиды выделяют из других штаммов Penicillium funiculosum или других нитчатых грибов. Альтернативно, такие полипептиды могут получать, например, способами направленного мутагенеза.

Объектом настоящего изобретения являются полипептиды, имеющие, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% аминокислотных остатков, идентичных полипептиду SEQ ID No.2.

Выражение “идентичные аминокислотные остатки” следует понимать как аминокислотные остатки, неизменные в двух последовательностях. Указанные полипептиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка по сравнению с полипептидом SEQ ID No.2.

Объектом настоящего изобретения являются также полипептиды, обнаруживающие, по меньшей мере, 90%, 95%, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% сходства с полипептидом SEQ ID No.2.

Выражение “сходство” следует понимать как степень схожести между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями. Указанные полипептиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка по сравнению с полипептидом SEQ ID No.2. Степень сходства двух последовательностей, рассчитываемая по результатам подсчета, основывается на доле совпадений и/или консервативных замен в сличаемых последовательностях.

Полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, выделяют или очищают из естественной для них среды. Способы получения полипептидов могут быть различными. Такими способами, в частности, являются очистка из природных источников, таких как клетки, естественно экспрессирующие упомянутые полипептиды; выработка рекомбинантных полипептидов подходящими клетками-хозяевами с последующей очисткой; получение при помощи химического синтеза или, наконец, сочетание этих различных подходов. Указанные различные способы получения хорошо знакомы специалистам. Так, полипептиды ABFB, соответствующие настоящему изобретению, могут быть выделены из Penicillium funiculosum. В другом варианте осуществления полипептиды ABFB, соответствующие настоящему изобретению, выделяют из рекомбинантных организмов-хозяев, экспрессирующих полипептид ABFB, соответствующий настоящему изобретению.

Объектом настоящего изобретения являются также гибридные белки, рекомбинантные белки или химерные белки, включающие полипептиды, соответствующие настоящему изобретению. Термин “полипептид” обозначает как белки, так и модифицированные полипептиды.

Полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, обладают активностью ABFB. Предпочтительно, полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, содержат домен связывания целлюлозы. В предпочтительном варианте осуществления домен связывания целлюлозы имеет последовательность, описываемую SEQ ID No.3. Предпочтительно, такие полипептиды проявляют максимальную -L-арабинофуранозидазную активность при рН 2,6. Предпочтительно, такие полипептиды проявляют максимальную -L-арабинофуранозидазную активность при 50°С.

Полинуклеотиды.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, имеющие активность -L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют -L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

В соответствии с настоящим изобретением выражение “полинуклеотид” следует понимать как однонитевую нуклеотидную цепь или комплементарную ей цепь, которые могут представлять собою ДНК или РНК; либо двунитевую нуклеотидную цепь, которая может представлять собою комплементарную или геномную ДНК. Предпочтительно, полинуклеотиды, соответствующие настоящему изобретению, представляют собой ДНК, в частности, двунитевую ДНК. Термин “полинуклеотид” обозначает также модифицированные полинуклеотиды.

Полинуклеотиды, соответствующие настоящему изобретению, выделяют или очищают из естественной для них среды. Предпочтительно, полинуклеотиды, соответствующие настоящему изобретению, могут быть приготовлены обычными для молекулярной биологии способами, такими, как описано у Sambrook et al. Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989, – или при помощи химического синтеза.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1. Этот полинуклеотид кодирует фермент ABFB-2 Penicillium funiculosum (SEQ ID No.2).

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Этот полинуклеотид кодирует зрелый полипептид ABFB-2 Penicillium funiculosum после отщепления сигнального пептида.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичность с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1, и/или с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Эти полинуклеотиды кодируют полипептиды, имеющие активность -L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют -L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

Выражение “идентичные нуклеотиды” следует понимать как нуклеотиды, неизменные в двух последовательностях. Указанные полинуклеотиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного нуклеотида по сравнению с эталонным полинуклеотидом.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам, обнаруживающим, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% предпочтительно, по меньшей мере, 99% сходства с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1, и/или с полинуклеотидом, последовательность которого заключена между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Эти полинуклеотиды кодируют полипептиды с активностью -L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют -L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

Выражение “сходство” следует понимать как степень схожести между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями. Указанные полинуклеотиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка по сравнению с эталонным полинуклеотидом. Степень сходства двух последовательностей, рассчитываемая по результатам подсчета, основывается на доле совпадений и/или консервативных замен в сличаемых последовательностях.

Предпочтительно, полинуклеотиды, обнаруживающие определенную степень сходства с эталонным полинуклеотидом, сохраняют функцию эталонной последовательности. В настоящем случае полинуклеотиды кодируют полипептиды с активностью -L-арабинофуранозидазы В.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, способным гибридизоваться избирательным образом с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1 и/или с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Предпочтительно, избирательную гибридизацию осуществляют в условиях средней жесткости, более предпочтительно, в условиях высокой жесткости. Эти полинуклеотиды кодируют полипептиды с активностью -L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют -L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

Выражение “последовательности, способные гибридизоваться избирательным образом” в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как последовательности, которые гибридизуются с эталонной последовательностью с уровнем гибридизации, значительно превышающим фоновый шум. Уровень сигнала, который возникает при взаимодействии последовательности, способной гибридизоваться селективным образом с эталонными последовательностями, обычно в 10 раз, предпочтительно, в 100 раз более интенсивен, нежели сигнал при взаимодействии других последовательностей ДНК, приводящем к образованию фонового шума. Жесткие условия гибридизации, способствующие селективной гибридизации, хорошо известны специалистам. Обыкновенно температура гибридизации и отмывки, по меньшей мере, на 5°С ниже, чем температура отжига последовательности при данной величине рН и для данной ионной силы. В типичном случае температура гибридизации составляет, по меньшей мере, 30°С для полинуклеотида длиной от 15 до 50 оснований и, по меньшей мере, 60°С для полинуклеотида длиннее 50-ти оснований. Гибридизацию осуществляют, для примера, в буфере состава: 6Х SSC, 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5), 1 мМ ЭДТА, 0.02% поливинилпирролидона, 0.02% Ficoll, 0.02% БСА, 500 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося. Отмывку осуществляют, например, последовательно в мягких условиях (в буфере 2Х хлорид натрия + цитрат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия), в условиях средней жесткости (в буфере 0,5Х хлорид натрия + цитрат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия) и в жестких условиях (в буфере 0,1X хлорид натрия + цитрат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия). Разумеется, гибридизацию могут осуществлять и другими обычными способами, хорошо знакомыми специалистам (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989). Предпочтительно, полинуклеотиды, гибридизующиеся избирательным образом с эталонной полинуклеотидной последовательностью, сохраняют функцию исходной последовательности. В настоящем случае полинуклеотиды, гибридизующиеся избирательным образом с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No. 1 и/или с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1, кодируют полипептиды с активностью -L-арабинофуранозидазы В.

Вообще говоря, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам кодирующим полипептиды, соответствующие настоящему изобретению. Ввиду вырожденности генетического кода различные полинуклеотиды могут кодировать один и тот же полипептид.

Другим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, последовательность которого соответствует SEQ ID No.1. Полинуклеотид SEQ ID No.1 включает в себя последовательности, фланкирующие открытую рамку считывания гена abfB-2 Penicillium funiculosum. Речь, в частности, идет о промоторных и терминаторных последовательностях гена abfB-2. Ген abfB может экспрессироваться при помощи регуляторных последовательностей, гомологичных указанным и вызывающих сверхэкспрессию, в частности, у Penicillium funiculosum или у других нитчатых грибов.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения ген abfB может быть экспрессирован в различных организмах-хозяевах, таких, например, как бактерии, дрожжи и грибы. Ген abfB может быть экспрессирован в организме-хозяине под контролем промотора согласно SEQ ID No.1 настоящего изобретения либо под контролем гетерологичного промотора.

Экспрессионные кассеты

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий полипептид, соответствующий настоящему изобретению, вводят в состав экспрессионной кассеты при помощи способов клонирования, хорошо знакомых специалистам. Эта экспрессионная кассета включает в себя элементы, необходимые для транскрипции и трансляции последовательностей, кодирующих полипептиды, соответствующие настоящему изобретению.

Такая экспрессионная кассета предпочтительно включает как элементы, обеспечивающие возможность выработки полипептида клеткой-хозяином и элементы, необходимые для регуляции этой экспрессии.

Такие экспрессионные кассеты включают в направлении транскрипции:

– промотор, способный функционировать в организме хозяина;

– полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению;

– терминаторную последовательность, способную функционировать в организме хозяина.

В экспрессионных кассетах, соответствующих настоящему изобретению, могут использоваться промоторные последовательности любого типа. Выбор промотора будет зависеть, в частности, от организма-хозяина, выбранного для экспрессии гена, представляющего интерес. Одни промоторы обеспечивают конститутивную экспрессию, тогда как другие промоторы, наоборот, индуцибельны. Среди промоторов, способных функционировать в грибах, можно отметить, в частности, промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current. Genet. 15:177-180, 1989). Среди промоторов, способных функционировать в бактериях, можно отметить, в частности, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Studier et al., Methods in enzymology 185:60-89, 1990). Среди промоторов, способных функционировать в дрожжах, можно отметить, в частности, промотор гена GAL 1 (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88:1731-1735, 1991) или промоторы GAL4 и ADH S.cerevisiae. Все эти промоторы описаны в литературе и хорошо известны специалистам.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum можно выбрать, например, экспрессионные кассеты, содержащие промотор гена гистона Н4 В, промотор кислой аспартилпротеазы или промотор csl13 (WO 00/68401).

В соответствии с настоящим изобретением экспрессионные кассеты могут дополнительно включать любую другую последовательность, необходимую для экспрессии полипептидов или полинуклеотидов, такую, например, как регуляторные последовательности или сигнальные последовательности, позволяющие полипептидам, выработанным в организме-хозяине, секретироваться. В частности, можно использовать любую регуляторную последовательность, позволяющую повысить уровень экспрессии кодирующей последовательности, включенную в состав экспрессионной кассеты. В соответствии с настоящим изобретением можно, в частности, использовать в сочетании с промоторной последовательностью и другие регулирующие последовательности, располагающиеся между промотором и кодирующей последовательностью, такие как активаторы транскрипции (“энхансеры”).

В экспрессионных кассетах, соответствующих настоящему изобретению, можно использовать большое количество различных терминаторов, обеспечивающих завершение транскрипции и полиаденилирование мРНК. При этом можно использовать любой терминатор, способный функционировать в выбранном организме-хозяине.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum можно выбрать, например, экспрессионные кассеты, включающие терминатор гистона Н4 В, терминатор кислой аспартилпротеазы или терминатор csl13 (WO 00/68401).

Объектом настоящего изобретения является также полинуклеотид, включающий экспрессионную кассету, соответствующую настоящему изобретению. Предпочтительно экспрессионные кассеты, соответствующие настоящему изобретению, включены в состав какого-либо вектора.

Векторы

Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам репликации или экспрессии для трансформации организма-хозяина. Такой вектор содержит, по меньшей мере, один полинуклеотид или одну экспрессионную кассету, соответствующие настоящему изобретению. Такой вектор, в частности, может соответствовать плазмиде, космиде, бактериофагу или вирусу, в которые введен полинуклеотид или экспрессионая кассета, соответствующие настоящему изобретению. Способы создания таких векторов и вставки в них полинуклеотидов хорошо известны специалистам. Говоря в общем, можно использовать любой вектор, способный к самоподдержанию, самостоятельной репликации или распространению в клетке-хозяине для обеспечения, в частности, экспрессии полинуклеотида или полипептида. Специалист сможет выбрать подходящие векторы в зависимости от организма-хозяина, подлежащего трансформации, и в зависимости от применяемой техники трансформации.

Векторы, соответствующие настоящему изобретению, используются, в частности, для трансформации организма-хозяина с целью репликации вектора и/или экспрессии полипептида, соответствующего настоящему изобретению, в организме-хозяине.

Настоящее изобретение относится также к способу получения полипептида, соответствующего настоящему изобретению, включающему следующие этапы:

– организм-хозяин трансформируют экспрессионым вектором, содержащим экспрессионную кассету, соответствующую настоящему изобретению, и/или полинуклеотидом, соответствующим настоящему изобретению;

– выделяют полипептиды, выработанные организмом-хозяином.

Организмы-хозяева

Объектом настоящего изобретения также является способ трансформации организма-хозяина посредством введения в указанный организм-хозяин, по меньшей мере, одного полинуклеотида или одной экспрессионной кассеты, или одного вектора, соответствующих настоящему изобретению. Полинуклеотид может быть встроен в геном организма-хозяина или реплицироваться устойчивым образом в организме-хозяине. Способы трансформации организмов-хозяев хорошо известны специалистам и широко описаны в литературе.

Настоящее изобретение относится также к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, экспрессионной кассетой или вектором, соответствующим настоящему изобретению. В частном случае настоящего изобретения выражение “организм-хозяин” следует понимать как любой одно- или многоклеточный организм, низший или высший, в частности, выбираемый среди бактерий, дрожжей и грибов. Выражение “организм-хозяин” следует понимать как организм, отличный от человеческого. Дрожжи предпочтительно выбирают из числа Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae, Yarrow/а lipolytica и Schwanniomyces occidentalis. Грибы выбирают из Aspergillus и Penicillium, предпочтительно, из Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii и Trichoderma koningii. В предпочтительном варианте осуществления организмом-хозяином является штамм Penicillium funiculosum, в котором экспрессируется или сверхэкспрессируется полипептид ABFB, соответствующий настоящему изобретению.

Способы создания векторов, трансформации организмов-хозяев и экспрессии чужеродных белков в этих организмах широко описаны в литературе (Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 и 2, Greene Publishing Associates et Wiley – Interscience, 1989; T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982).

Кормовые добавки и корма для животных

Настоящее изобретение относится также к кормовым добавкам, привносящим -L-арабинофуранозидазную активность типа В. Привнесение ферментативной активности такого типа позволяет улучшить перевариваемость корма для животных и повысить его питательную ценность.

Выражение “кормовая добавка” следует понимать как вещество, намеренно добавляемое к корму, обыкновенно в незначительных количествах, для улучшения питательных свойств или перевариваемости корма. Кормовые добавки для животных могут, в частности, содержать витамины, минеральные соли, аминокислоты и ферменты.

В типичном случае в соответствии с настоящим изобретением кормовые добавки для животных содержат полипептид, соответствующий настоящему изобретению, организм-хозяин, соответствующий настоящему изобретению, или ферментационное сусло из оранизма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению. Так полипептиды, обладающие активностью -L-арабинофуранозидазы В, соответствующие настоящему изобретению, могут быть очищены или выделены из штамма Penicillium funiculosum или из рекомбинантного организма-хозяина для производства кормовой добавки для животных. В другом варианте для производства кормовой добавки для животных могут быть использованы непосредственно штамм Penicillium funiculosum или организм-хозяин, вырабатывающий полипептиды AbfB. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения для производства кормовых добавок для животных применяются культуральная среда или ферментационное сусло из Penicillium funiculosum или организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению. Этот вариант осуществления особенно предпочтителен, когда полипептиды ABFB секретируются штаммом Penicillium funiculosum или организмом-хозяином. Обыкновенно кльтуральный супернатант для производства кормовой добавки выпаривают или лиофилизуют.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу получения фермента ABFB, который включает следующие этапы:

а) культивирование штамма Penicillium funiculosum или организма-хозяина, трансформированного в соответствии с настоящим изобретением, в условиях индукции экспрессии ABFB;

б) отделение культурального супернатанта, содержащего фермент ABFB.

Такой культуральный супернатант или ферментационное сусло могут затем концентрировать или лиофилизировать для составления кормовой добавки или корма для животных.

Если организм-хозяин не секретирует фермент ABFB в культуральную среду, может оказаться необходимым дополнительный этап дезинтеграции клеток и очистки клеточного экстракта.

Кормовые добавки, соответствующие настоящему изобретению, включают активность -L-арабинофуранозидазы В, но могут содержать и другие питательные вещества, такие как витамины, аминокислоты или минеральные соли.

Добавки, соответствующие настоящему изобретению, повышают перевариваемость кормов, внося, таким образом, свой вклад в повышение питательной ценности диет, в частности, на основе злаков (пшеница, ячмень, кукуруза, овес, рожь и т.п.) и масличных жмыхов (соя, подсолнечник, рапс и т.п.).

Настоящее изобретение также относятся к кормам для животных, содержащим основу питания и кормовую добавку, соответствующую настоящему изобретению. Эти корма обычно представлены в виде муки или гранул, в состав которых включены добавки, соответствующие настоящему изобретению.

Выражение “корм” следует понимать как все то, что может служить для питания животных.

Корма содержат полипептид, соответствующий настоящему изобретению, организм-хозяин, соответствующий настоящему изобретению, или ферментационное сусло из организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению.

Для интенсивного разведения животных эти корма содержат обыкновенно основу питания и кормовые добавки.

Выражение “основа питания” следует понимать как то, что составляет основную часть питательного рациона животного и состоит, например, из смеси злаков, белков и жиров растительного и/или животного происхождения.

Основы питания для животных приспособлены для этих животных и хорошо знакомы специалистам. Обыкновенно такие основы питания включают, например, кукурузу, пшеницу, горох и сою. Такие основы питания приспособлены к потребностям различных видов животных, для которых они предназначаются. Эти основы питания могут уже содержать кормовые добавки, такие как витамины, минеральные соли и аминокислоты.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение касается кормов для животных с однокамерным желудком, в частности, для домашней птицы и свиней. Домашняя птица, в частности, включает кур-несушек, мясных цыплят, индеек и уток. Свиньи включают в частности, свиней на откорм, а также поросят.

Описание фигур

Фиг.1: Схема организации области связывания целлюлозы у грибов (fCBD).

Фиг.2: Определение оптимального рН для фермента ABFB-2 в серии буферов Мак-Илвайна (рН от 2,2 до 8) при 40°С в присутствии 5 мМ ара-нитрофенил-L-арабинофуранозида(РНРАF).

Фиг.3: Определение оптимальной температуры для фермента ABFB-2 при оптимальном рН в присутствии 5 мМ PNPAF.

Фиг.4: Определение кинетических постоянных K_m и V_m (1/Vi=f(1/S)) ABFB-2 для спектра концентраций PNPAF от 0,5 мМ до 5 мМ при рН 2,6 и температуре 50°С.

Фиг.5: Значения дифференциальной экспрессии генов abfB-1 и ahfB-2 в зависимости от условий роста Р. funiculosum.

Фиг.6: Кинетика исчезновения ABFB-2 в супернатанте реакционной среды. Адгезию фермента к целлюлозе отслеживают, измеряя активность остаточной свободной -L-арабинофуранозидазы В ABFB-2.

Примеры

Анализ структуры гена ABFB-2

ABFB-2 обнаруживает менее 62% идентичности с другими ферментами ABFB нитчатых грибов, тогда как обычно эти ферменты довольно консервативны. Эта разница объясняется фактом обнаружения двух различных областей. В N-концевой части находится область, специфичная для арабинофуранозидаз (с 10 по 341 аминокислотный остаток), а в С-концевой части – область связывания целлюлозы “грибного” типа fCBD (fungal-type cellulose-binding domain), которая была предсказана при помощи анализа SMART (Simple Modular Architecture Research Tool – инструмент исследования архитектуры из простых модулей) между аминокислотными остатками 367 и 400. В соответствии с литературой домены связывания такого типа обыкновенно обнаруживаются в ферментах, задействованных в расщеплении целлюлозы, таких как эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4), целлобиогидролазы (экзоглюканазы) (ЕС 3.2.1.91) или ксиланазы (ЕС 3.2.1.8). Это первый случай, когда домен связывания целлюлозы (CBD – cellulose binding domain) выявляют в арабинофуранозидазе.

С точки зрения структуры (первичная последовательность) целлюлазы и ксиланазы состоят из двух разных доменов: каталитического домена и домена связывания целлюлозы, связанных между собой короткой последовательностью, т.наз. последовательностью низкой сложности, богатой пролином и/или оксиаминокислотами (серином и треонином). Домены связывания целлюлозы были изучены в некоторых целлюлазах грибов, они характеризуются последовательностью длиною до 36 аминокислотных остатков, представленной на N-конце (cbh-11 или eg12) или С-конце белка (cbh-1, egh или eg15). Сверх того, доменам такого типа свойственны 4 консервативных остатка цистеина (фиг.1), которые позволяют образование дисульфидных мостиков.

Домен fCBD, предсказанный для ABFB-2 Penicillium funiculosum, состоит из 34 аминокислотных остатков, включая 4 консервативных цистеина (THWGQCGGSGYSGPTSCVAPYACTTANPYYAQCL).

Этому домену предшествует характерная короткая последовательность низкой сложности из 23 аминокислотных остатков (STSPGSHTTSTTLTTITSTTAVS), богатая аминокислотными остатками, несущими гидроксильную группу, (10 остатков треонина и 6 остатков серина). У Penicillium funiculosum домен такого типа был описан для трех других ферментов: эндо-1-4-ксиланазы, целлобиогидролазы и кислой ферулинэстеразы (цианомилэстеразы). Выравнивание этих 4-х последовательностей подтверждает консервативность и расположение 4-х цистеиновых остатков в составе fCBD.

Выравнивание fCBD, известных у Penicillium funiculosum.

Домен связывания такого типа широко описан в составе целлюлолитических ферментов (целлюлаз). Анализ первичной последовательности fCBD путем выравнивания с известными последовательностями fCBD выявляет весьма сильную гомологию с доменами связывания целлюлозы в составе целлобиогидролаз типа I и II, а также с соответствующими доменами эндоглюканаз типа I, II и V, происходящих из Trichoderma reesei и Aspergillus niger. В составе последовательности ABFB-2 есть 3 консервативных остатка тирозина, а также остатки аспарагина и глутамина, для которых показано, что они являются существенными для функционирования этого домена. Структурно-функциональные исследования показывают, что домены такого типа играют решающую роль в деполимеризации целлюлозы (binder, М. & Teeri, Т.Т. (1997) The roles and function of cellulose-binding domains, J. Biotechnol. 57 15-28), повышая сродство фермента к своему субстрату. Целлобиогидролаза I (CBH I) Т. reesei в отсутствие домена fCBD сохраняет свою каталитическую активность, однако сродство фермента к субстрату при этом существенно понижается.

Это первый случай, когда домен связывания такого типа выявляют в арабинофуранозидазе типа В нитчатого грибка. Присутствие этого домена связывания повышает сродство фермента к своему субстрату и, вследствие этого, позволяет улучшить расщепление нерастворимой целлюлозы.

Разработка определения активности -L-арабинофуранозидазы В

-L-арабинофуранозидазную активность измеряли в культуре Р. funiculosum в среде М2 с добавлением смеси, состоящей из 0,15% Provasoy и 0,3% целлюлозы спустя 40 час. Отбор проб осуществляли через 48 и 72 часа культивирования. Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера на 200 мл с полезным объемом 50 мл. Активность определяли посредством гидролиза 5 мМ пара-нитрофенил-L-арабинофуранозида (PNPAF) в буфере 50 мМ ацетата натрия рН 5. Для этого 50 мкл культуральной среды выдерживали с 250 мкл субстрата, предварительно нагретого до 50°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 0,5 М NaOH. Высвобождение п-нитрофенила (PNP) измеряли при 405 нм с коэффициентом молярного поглощения 17000 M-1.см-1 Единицу ферментативной активности определяли как количество фермента, гидролизующее 1 мкмоль PNPAF в минуту в вышеописанных условиях. Для культуры Р. funiculosum получили величины 20 мЕд.мл-1 через 48 часов культивирования и 112 мЕд.мл-1 через 72 часа культивирования. Полученные результаты согласуются с литературой. Так, для Aspergillus niger были получены величины порядка от 100 до 600 мЕд.мл-1, в зависимости от индуктора, используемого при культивировании.

Клонирование открытой рамки считывания abfB P. funiculosum и трансформация Saccharomyces cerevisiae

На основе геномной ДНК Р. funiculosum, посредством ПЦР при помощи пары праймеров (Hind IM-abfB-2/Xba 1-abfB-2) амплифицировали ген abfB-2 в следующих условиях (94°С, 30 сек); 62°С, 30 сек; 1 мин 30 сек при 72°С), 30 циклов. Продукт ПЦР в 1215 п.н. клонировали в коммерческом векторе pGEM-T easy.

Последовательности пары праймеров для ПЦР:

Xba I-abfB-2:>5′-ТЦТАГААТГАЦГТЦЦАААЦАТАГТТ-3′<

Hind III-abfB-2:>5′-ААГЦТТЦТАГАГАЦАТТГАГЦГТА-3′<

Фрагмент Hind Ill/Xba I в 1215 п.н. вырезали из вектора pGEM-T и субклонировали в участках Hind Ill/Xba I в векторе-челноке pJL 52 (plac195-PGK/CYCI). Гетерологичная экспрессия гена abfB-2 находится, таким образом, под контролем конститутивного промотора PGK гена фосфоглицераткиназы (S. cerevisiae) и терминатора CYC1 (S. cerevisiae) гена цитохром-С-оксидазы. Полученный экспрессионный вестор получил название рОТ-02.

Штамм S. cerevisiae JF #1194 (CEN.PK113-5D) – клон, происходящий от штамма CEN.PK 122 с ауксотрофией ura 3-52, трансформировали (способ с ацетатом лития/температурным шоком) экспрессионным вектором рОТ-02. Трансформированные штаммы отбирали посредством фенотипического дополнения на селективных чашках без урацила (маркер URA3).

Для испытания на присутствие активности арабинофуранозидазы B в культуральной среде отобрали шесть трансформированных штаммов. Трансформированные штаммы культивировали в течение суток в 50 мл минимальной среды без урацила (кроме контрольного штамма дикого типа). Арабинофуранозидазную активность определяли в культуральной среде способом, описанным в предыдущем параграфе.

Определение рН-оптимума

Ген abfB-2, кодирующий активность арабинофуранозидазны В из Р. funiculosum клонировали в S. cerevisiae. После проверки присутствия арабинофуранозидазной активности типа В нескольких трансформированных штаммах выбрали один из этих штаммов, и после суточного роста в культуральной среде определили активность ABFB. Культивирование осуществляли в конических колбах Эрленмейера на 200 мл (полезный объем 50 мл). Активность определяли в присутствии 5 мМ п-нитрофенил--L-арабинофуранозида (PNPAF) в серии буферов Мак Илвайна (рН от 2,2 до 8,0). 80 мкл культуральной среды выдерживали 10 мин с 320 мкл субстрата, предварительно нагретого до 40°С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 1М Na₂CO₃. Уровень высвобождения п-нитрофенила измеряли при 405 нм. Единицу ферментативной активности определяли как количество фермента, способное гидролизовать 1 мкмоль PNPAF в минуту. Кривая активности приведена на фиг.2. Для ABFB-2 максимум активности достигается при рН 2,6, а при рН 3,8 фермент сохраняет 55% своей активности. Это первый случай обнаружения такого низкого значения рН-оптимума для арабинофуранозидазы; она даже сохраняет 68% своей активности при рН 1,5 в 50 мМ НСl.

Определение оптимальной температуры

В соответствии с тем же протоколом определяли температуру, оптимальную для активности ABFB-2. Фермент выдерживали 10 мин при каждом значении температуры в буфере Мак Илвайна с рН 2,6. Кривая активности представлена на фиг.3.

В литературе указывается, что диапазон оптимальных температур для ABFB составляет от 40 до 60°С. ABFB-2 Р. funiculosum имеет оптимум активности при 50°С. При помещении ABFB-2 в оптимальные условия (рН 2,6; 50°С) отмечается в 20 раз более высокая активность ABFB-2, чем в ацетатном буфере с рН 5 при 40°С (305 мЕд по сравнению 15 мЕд).

Определение K_m и V_m

Каждую из кинетических постоянных (K_m и V_m) для ABFB-2 определяли по гидролизу PNPAF в течение времени при оптимальных условиях, определенных ранее.

Субстрат (PNPAF) использовали в различных фиксированных концентрациях от 0,5 до 5 мМ в буфере рН 2,6. Кинетику гидролиза отслеживали в течение 10 мин при 50°С. Для получения кинетических постоянных для каждого из ферментов результаты обрабатывали способом двойных обратных величин (по Лайнвиверу-Берку). Результаты представлены на фиг.4.

Кинетические постоянные определяли по гидролизу PNPAF в оптимальных условиях. Величина K_m для ABFB-2 составляет 0,7 мМ. По литературным данным, значения K_m для ферментов этого типа варьируют от 0,05 до 1,2 мМ, в зависимости от рода и вида изучаемого грибка. Максимальная скорость гидролиза (V_m) для ABFB-2 составляет 328 моль PNPAF/моль фермента/мин в описанных выше условиях.

Определение молекулярной массы фермента ABFB-2

Для определения молекулярной массы фермента ABFB-2 культуральную среду после роста в ней, по меньшей мере, одного мутанта (S. cerevisiae) концентрировали в 200 раз, денатурировали кипячением при 100°С в течение 5 мин и наносили на полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия.

Обнаружили, что в случае штамма дикого типа количество внеклеточных белков весьма незначительно. В случае же мутантов в культуральную среду секретируется фермент ABFB-2. Этот полипептид является мажорным по отношению к исходному уровню внеклеточных белков S. cerevisiae. Электрофоретическая зона, соответствующая ферменту ABFB-2, оказалась размытой, что может говорить о высоком уровне гликозилирования фермента.

Определение молекулярной массы осуществляли с помощью маркеров молекулярной массы SeeBlue (Invitrogen). Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1
Молекулярная масса ABFB-2 в кДа
	Предсказанная мол. масса	Мол. масса, определенная в геле
ABFB-2	41	55

Сравнили молекулярную массу, предсказанную на основании алгоритма Vector NTi и молекулярную массу, определенную по электрофоретической миграции в денатурирующем полиакриламидном геле с додецилсулфатом натрия. Мы обнаружили завышенное значение молекулярной массы по данным гель-электрофореза в полиакриламидном геле с ДДС-Na. Обнаружение на геле размытой электрофоретической зоны (О- и N-гликозилирование) говорит о том, что фермент сильно гликозилирован. Такое гликозилирование происходит в ходе созревания белков в экспрессирующем их организме.

Анализ профиля экспрессии гена abfB-2 в Penicillium funiculosum

Penicillium funiculosum обладает двумя генами, кодирующими фермент, имеющий активность -L-арабинофуранозидазы В: гены abfB-1 и abfB-2. Профили экспрессии этих генов сравнили в различных условиях культивирования Р. funiculosum.

Р. funiculosum культивировали в условиях и индукции целлюлолитических и гемицеллюлолитических ферментов (промышленная культуральная среда типа М2) и в условиях отсутствия такой индукции (минимальная глюкозная среда МО). По истечении 40 часов роста культивирование прекращали, мицелий отбирали и экстрагировали из него тотальную РНК. Количество и качество РНК оценивали измерением оптического поглощения при 260 и 280 нм (отношение 260/280>1,8). Уровень транскриптов, кодирующих полипептиды, имеющие активность арабинофуранозидазы типа В (ABFB-1 и ABFB-2), количественно определяли для обоих типов условий выращивания (М0 и М2) посредством количественной ПЦР в реальном времени.

Ген, кодирующий тубулин (tub-1) P. funiculosum использовали в качестве контроля в обоих типах условий выращивания. Этот ген кодирует структурный белок, необходимый для целостности клетки. Этот ген широко используется как эталонный, поскольку уровень его экспрессии постоянен вне зависимости от условий культивирования.

Для каждого из генов (abfB-1, abfB-2 и tub-1) сконструировали специфические праймеры для количественной ПЦР. Для обоих условий выращивания (М2 и М0) проводили обратную транскрипцию 2 мкг тотальной РНК. Была осуществлена серия разведений комплементарных ДНК, полученных в результате обратной транскрипции, с целью определить оптимальные условия амплификации генов-мишеней (критичные для метода количественной ПЦР и для эффективности пар праймеров),

Нормализованные результаты представлены в таблице 2 и фиг.5.

Таблица 2
Значения дифференциальной экспрессии генов abfB-1 и abfB-2 в зависимости от условий роста Р. Funiculosum
	М0	М2
abfb1	1	107
abfb2	1	1,27

Регуляция транскрипции генов, кодирующих целлюлолитические и гемицеллюлолитические активности, описана в литературе. Экспрессия этих генов сильно зависит от природы и химического состава источника углерода и азота, на котором культивируется микроорганизм. Было отмечено значительное подавление транскрипции этих генов в присутствии глюкозы. Такая регуляция осуществляется через посредство катаболического белка-репрессора CreА, который специфически закрепляется на промоторе этих генов и блокирует их транскрипцию. В данном случае в эксперименте по количественному определению матричных РНК abfB-1 и abfB-2 посредством ПЦР уровень экспрессии этих двух генов в присутствии глюкозы (М0) весьма низок. Это находится в согласии с литературными данными, поскольку, как было показано, вышеупомянутые гены экспрессированы на некоем базовом уровне даже в не благоприятствующих им условиях (отсутствие целлюлоидных и/или гемицеллюлоидных субстратов). Результаты, полученные для М0, соответствуют литературе. В отличие от гена abfB-1 экспрессия гена abfB-2 не индуцируется в промышленных условиях. Это говорит о том, что ферментная смесь, вырабатываемая Penicillium funiculosum, могла бы быть улучшена при осуществлении экспрессии ABFB-2 грибком в промышленных условиях, либо при добавлении экзогенного ABFB-2 к вырабатываемой ферментной смеси.

Определение функциональной активности fCBD

Для проверки функциональной активности домена fCBD осуществляли испытания на связывание фермента ABFB-2 на микрокристаллической целлюлозе.

Фермент смешивали с равным объемом 0,5%-ной взвеси микрокристаллической целлюлозы в буфере 100 мМ трис-НСl рН 7,5 при 4°С. Адгезию белка отслеживали по измерению остаточной активности арабинофуранозидазы B в присутствии PNPAF в условиях гидролиза, определенных как оптимальные. Через различные промежутки времени контакта фермента с целлюлозой смесь центрифугировали, и отслеживали уменьшение концентрации белка ABFB-2 посредством измерения активности арабинофуранозидазы B в супернатанте. Испытания на связывание осуществляли в сравнении с контролем, содержащим фермент ABFB-2, в тех же опытных условиях, но в отсутствие микрокристаллической целлюлозы. Другой контроль состоял в выдерживании фермента ABFB-1 в тех же условиях в присутствии микрокристаллической целлюлозы. Полученные результаты приведены на фиг.6.

Оказалось, что область связывания целлюлозы “грибного” типа (fCDB) в составе фермента ABFB-2 из Р. funiculosum является функционально активной. Адсорбцию фермента определяли через 10 и 45 мин контакта с целлюлозой. Через 10 мин инкубации на микрокристаллической целлюлозе закрепляется 70% общего количества фермента, присутствовавшего в растворе в начальный момент. Через 45 мин связывается 80% общего количества фермента, присутствующего в сфере реакции. Эти данные позволяют считать, что равновесие реакции контакта достигается очень скоро, и что кинетика адгезии фермента, совершенно очевидно, подчиняется кинетическому закону первого порядка по отношению к субстрату в течение первых 10 мин.

Формула изобретения

1. Полипептид, обладающий -L-арабинофуранозидазной активностью, отличающийся тем, что он содержит полипептид, выбранный из следующих полипептидов:
полипептид согласно SEQ ID No.2,
полипептид, аминокислотная последовательность которого находится между положениями 28 и 400 SEQ ID No.2,
фрагмент полипептида согласно SEQ ID No.2, обладающий активностью -L-арабинофуранозидазы В,
полипептид, обладающий активностью -L-арабинофуранозидазы В и проявляющий, по меньшей мере, 80% идентичность с полипептидом SEQ ID No.2.

2. Полинуклеотид, кодирующий активность -L-арабинофуранозидазы В, отличающийся тем, что он выбран из следующих полинуклеотидов:
полинуклеотид, последовательность которого находится между положениями 268 и 1470 SEQ ID No.1,
полинуклеотид, последовательность которого находится между положениями 349 и 1470 SEQ ID No.1,
полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1.

3. Полинуклеотид, кодирующий -L-арабинофуранозидазу, отличающийся тем, что он имеет последовательность согласно SEQ ID No.1 или последовательность, комплементарную SEQ ID No.1.

4. Экспрессионная кассета, отличающаяся тем, что она включает в направлении транскрипции:
промотор, способный функционировать в организме-хозяине;
полинуклеотид по п.2 и
терминаторную последовательность, способную функционировать в том же организме-хозяине.

5. Вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по п.2 или 3 и/или экспрессионную кассету по п.4.

6. Организм-хозяин, представляющий собой дрожжи или грибы, трансформированный полинуклеотидом по п.2 или 3, и/или экспрессионной кассетой по п.4, и/или вектором по п.5.

7. Организм-хозяин по п.6, отличающийся тем, что он выбран из дрожжей и нитчатых грибов.

8. Организм-хозяин по п.7, отличающийся тем, что он является штаммом Penicillium funiculosum.

9. Применение полипептида по п.1 или организма-хозяина по любому из пп.6-8 для гидролиза -L-арабинофуранозильных связей в арабинофуранозилолигосахаридных соединениях.

РИСУНКИ