Патент на изобретение №2388813

(54) СПОРОВЫЙ ПРОБИОТИК КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению нового лекарственного средства, предназначенного для ингибирования патогенных и условно-патогенных бактерий и вирусов. Споровый препарат включает, в мас.%: биомассу штамма Bacillus subtilis 282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)×10⁸-10¹⁰ КОЕ в 1 мл растворителя или лизаты биомассы штамма Bacillus subtilis 282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)×10⁸-10¹⁰ КОЕ в растворителе – 92-95 и наполнитель – 5-8. В задачу исследований входило – получить пробиотик с более выраженной амилолитической и антагонистической активностями в отношении болезнетворных микроорганизмов. Это обеспечивает расширение спектра антагонистической активности по отношению к болезнетворным микроорганизмам и устойчивость к ряду антибиотиков, повышение бактерицидной активности в отношении различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. 11 табл.

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению нового пробиотика из бактерий рода Bacillus, предназначенного для ингибирования развития патогенных бактерий и вирусов.

Традиционная терапия бактериальных заболеваний включает широкое использование антибиотических препаратов. Они часто являются токсическими и обладают неспецифическим бактерицидным действием, в том числе подавляют эндогенную микрофлору, что приводит к развитию различных осложнений, например дисбактериозам.

В настоящее время предложены новые антибактериальные препараты, обладающие выраженной активностью против патогенных и условно-патогенных бактерий и не нарушающие микробиоценозов.

К таким препаратам, обладающим хорошим лечебным эффектом, относятся препараты на основе бактерий рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных, гнойно-воспалительных, урогенитальных заболеваний и не дающих осложнений в виде аллергий и дисбактериозов.

Известен профилактический биопрепарат субалин, который содержит биомассу Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 при следующем соотношении компонентов, об.%:

Биомасса Bacillus subtilis ВКПМВ-4759
(1×109-1×1010 живых микробных клеток в 1 мл
физиологического раствора)	92-98
Наполнитель	2-8 (1).

Известен также лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus subtilis 11 В (ВКМ В-2218Д и ИБФМ РАН) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биомасса Bacillus subtilis 11 В
(1-5×109 живых микробных клеток в 1 мл
растворителя)	92-98
Наполнитель	5-8 (2).

Терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении условно-патогенной микрофлоры и восстановлении нормофлоры. Доказаны его абсолютная безвредность и хорошая переносимость (2).

В задачу исследований входило – создание пробиотика комплексного действия, который характеризовался более выраженной антагонистической и бактерицидной активностью в отношении болезнетворных микроорганизмов за счет амилолитической активности.

Поставленную задачу удалось достичь благодаря тому, что в состав предложенного пробиотика ввели культуру B.subtilis 3А (282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича), характеризующуюся высокими антагонистической и амилолитической активностями.

Технический результат изобретения заключается в расширении спектра антагонистической активности по отношению к болезнетворным микроорганизмам и устойчивости к ряду антибиотиков, повышении бактерицидной активности в отношении различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Предлагаемый штамм B.subtilis 3А (282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича) характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки: грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2-3×0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в центре клетки. При спорообразовании клетки не раздуваются.

Культурально-морфологические свойства. Штамм B.subtilis 3А (282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича) хорошо растет на простых питательных средах. На МПА после инкубации в течение 24 часов при температуре (37±1)°С штамм образует колонии от беловато-бежевого до желтого цвета с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, сухие или вязкой консистенции, может образовать до 50% гладких блестящих круглых колоний или колоний неправильной формы.

На мясопептонном бульоне (МПБ) растет в виде беловатой пленки и придонного осадка, вызывая помутнения среды. Оптимальная температура роста микроба (37±1)°С.

Ферментативные свойства. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, манит. Не разлагает лактозу. Не образует индол, сероводород. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Продуцирует каталазу, протеазу, желатиназу, амилазу. Не образует лецитиназу, липазу, уреазу. Изучаемая культура характеризуется отсутствием гемолитической активности (табл.1).

Таблица 1
Физиолого-биохимические свойства штамма B.subtilis 3А
Свойства	B.subtilis 3А
1	2
Рост в анаэробных условиях	–
Ферментация
Глюкозы	+
арабинозы	+
ксилозы	+
маннита	+
Утилизация
цитрата	+
пропионата	–
Гидролиз
крахмала	+
мочевины	–
Редукция нитратов	+
Образование газа из NO3– в анаэробных условиях
Обесцвечивание метиленовой сини	+
Аргининдигидролаза	–
Лецитиназа	–
Гиалуронидаза	–
Гемолитическая активность	–
Образование глобул поли--оксимасляной кислоты на глюкозном агаре
Лизоцимная активность	+

Как свидетельствуют данные, секционированный штамм Bacillus subtilis 3А характеризуется типичными для этого вида физиолого-биохимическими признаками, которые могут обусловить широкий диапазон положительного действия при применении.

Антибиотикочувствительность. Исследования антибиотикоустойчивости штамма В.subtilis 3А в отношении антибиотиков и антибиотических веществ, широко применяемых в практике здравоохранения, показали, что штамм обладает устойчивостью к ампициллину, бензилпенициллину, азтреонаму, цефтазидиму, цефтизоксиму и полимиксину Е (табл.2).

Таблица 2
Антибиотикочувствительность штамма B.subtilis 3А
Изучаемый препарат	Диаметр зон задержки роста культур, мм
	B.subtilis 3А
Амоксициллин	18±0,1
Ампициллин	10±0,3
Мезлоциллин	20±0,3
Метициллин	18±0,1
Оксациллин	14±0,3
Бензилпенициллин	8±0,1
Азтреонам	0
Имипенем	36±0,4
Моксалактам	12±0,3
Цефалотин	32±0,5
Цефамандол	37±0,1
Цефоперазон	16±0,1
Цефотаксим	14±0,2
Цефтазидим	8±0,2
Цефтизоксим	0
Цефтриаксон	18±0,3
Амикацин	20±0,2
Гентамицин	24±0,2
Канамицин	23±0,1
Тобрамицин	24±0,3
Ванкомицин	12±0,1
Клиндамицин	10±0,3
Тетрациклин	24±0,3
Хлорамфеникол	16±0,2
Полимиксин Е	10±0,1
Нитрофурантоин	16±0,2
Триметоприм	24±0,1
Норфлоксацин	24±0,2

Антагонистическая активность. Штамм Bacillus subtilis 3A наибольшую антагонистическую активность проявляет к тест-штаммам S.aureus (от 19,9 до 24,9 мм) и Candida albicans (до 36,5 мм), несколько ниже к – S.sonnei, S.flexneri (табл.3). Следует отметить, что штамм не проявляет антагонистическую активность в отношении представителей нормальной микрофлоры – бифидо-, лактобактерий и кишечной палочки.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, штамм В.subtilis 3А характеризуется широким спектром высокой антагонистической активности в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов и, в то же время, не влияет на бактерии – представителей нормальной микрофлоры.

Продукцию биологически активных веществ (БАВ) штаммом В.subtilis 3А изучали методом диффузии в агар. О продукции БАВ судили по зонам задержки роста тест-культур.

Тест-культуры в концентрации 10⁸ КОЕ/мл засевали на поверхность агаризованной среды (100 мкл суспензии/чашку). Сверлом (диаметр 6 мм) в агаре делали лунки, в которые вносили по 100 мкл лизата культуры В.subtilis 3A. Чашки культивировали при 37°С в течение 24-48 часов. Активность препарата определяли по зонам угнетения роста штаммов.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что пробиотический штамм В.subtilis 3А продуцирует биологически активные вещества широкого спектра специфического действия.

Безопасность пробиотического штамма

Изучали острую и хроническую токсичность штамма В.subtilis 3А. Опыты проводили на белых мышах массой 10-12 г. При изучении острой токсичности животным вводили культуру В.subtilis 3А внутривенно, внутрибрюшинно и перорально в различных концентрациях. При изучении хронической токсичности животным вводили культуру перорально по 10⁶ микробных клеток ежедневно в течение 10 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор. В таблице 5 представлены данные о действии максимальных доз, вводимых мышам при изучении острой токсичности. Результаты изучения хронической токсичности культуры представлены в таблице 6.

Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней.

Через 1 и 7 суток по 5 животных из каждой группы умерщвляли глубоким эфирным наркозом и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, а также отбирали различные органы для гистологического изучения: печень, почки, легкие, селезенку, кишечник, мезентериальные лимфатические узлы, головной мозг, тимус, мягкие ткани в области глотки (последние только при оральном введении). Материал фиксировали в растворе формалина, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Проводили в таком же объеме гистологические исследования органов контрольных животных.

В течение всего периода наблюдения животные были здоровы, хорошо поедали пищевые рационы, поведенческие реакции не нарушены, шерстный покров не изменен. Макроскопическое и гистологическое изучение внутренних органов животных не выявило никаких патологических изменений даже в группах животных, получавших максимальное количество бактериальных клеток.

Таким образом, штамм В.subtilis 3А характеризуется высокой степенью безопасности для животных.

Пример 1

Штамм В.subtilis 3А на среде Громыко (МПА+сусло-агар 1:1) при 37°С в течение 48 часов. Бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и прогревали при 121°С в течение 15 мин. Полученный лизат разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности). В другом варианте бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности).

Вариант 1

Лизат биомассы штамма В.subtilis 3А – 1×10⁹ КОЕ/мл

Вариант 2

Лизат биомассы штамма В.subtilis 3A – 1×10¹⁰ КОЕ/мл

Вариант 3

Лизат биомассы штамма В.subtilis 3A – 1×10¹¹ КОЕ/мл

Вариант 4

Биомасса штамма В.subtilis 3A – 1×10⁹ КОЕ/мл

Вариант 5

Биомасса штамма В.subtilis 3A – 1×10¹⁰ КОЕ/мл

Вариант 6

Биомасса штамма В. subtilis 3A – 1×10 КОЕ/мл

Изучали антагонистическую активность полученных вариантов препарата в отношении тест-культур (Таблица 7).

Как видно из данных, приведенных в таблице 7, оптимальным количеством микробных клеток в 1 мл препарата является – В.subtilis 3A – 1×10⁹-1×10¹⁰ КОЕ/мл, как живых клеток, так и их лизатов. Дальнейшее увеличение количества бактериальных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Предложенный штамм В.subtilis 3A депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером В.subtilis 282 (04.04.2007).

I. Получение живого препарата

Пример 2. Получение жидкого препарата

При стационарной технологии культивирование штамма ведется на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38°С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончании инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, осуществляют стабилизатором, разливают во флаконы.

При промышленной технологии культивирование штамма ведется в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38°С в течение от 10-18 ч. Процесс считается законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончании инкубации в выращенную культуру добавляют стабилизатор, разливают во флаконы.

Пример 3. Получение препарата в форме лиофилизата

При стационарной технологии культивирование штамма ведется на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38°С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончании инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, осуществляют защитной средой, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

При промышленной технологии культивирование штамма ведется в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38°С в течение от 10-18 ч. Процесс считается законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончании инкубации в выращенную культуру добавляют стабилизатор, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

В качестве защитной среды может содержать, например, сахарозо-желатиновую среду, молоко, желатозу, сахарозу, лактозу.

Пример 4. Получение препарата в таблетированной форме

Выращенную культуру штамма В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами и прессуют на ротационных прессах. При формировании таблеток может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, лактозу, сахарозу, стеарат кальция, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п.

На стабильность изучено 10 экспериментальных серий таблетированного препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В.subtilis 3A в таблетках составляет не менее 10^9-7 КОЕ/дозе (соответственно). После хранения таблеток на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 10^9-7 КОЕ/дозе.

Пример 5. Получение препарата в форме суппозиториев

Выращенные культуры штаммов В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями и отливают на свечных машинах. При получении суппозитории или свечи в качестве наполнителя содержат, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.

На стабильность изучено 10 экспериментально-производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В.subtilis 3A в суппозиториях составляет не менее 10^9-7 КОЕ/ суппозиторий (соответственно). После хранения суппозиториев на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 10^9-7 КОЕ/суппозиторий.

Пробиотик может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметилцеллюлозе, гидроксиэтилцеллюлозе, хитоне и т.п.

Проверяли все полученные варианты и формы препарата на безвредность на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур – представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.

Препарат характеризуется безвредностью.

Для определения безвредности содержимое флакона разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не меньше 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение 5 суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Препарат характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 ч, а затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500 – миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур.

Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе 2 без исследуемой культуры.

Из полученных данных следует, что оптимальным количеством живых клеток в одной дозе препарата является 1-5×10⁹. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

II. Получение инактивированного препарата

Для получения лизатов клеток суспензию (полученную стационарной (А) или промышленной (Б) технологии) автоклавируют при температуре (110±1)°С 1 атм 10-30 мин.

Пример 6. Полученную суспензию лизатов контролируют на подлинность и микробиологическую чистоту. Затем суспензию разливают дозатором в стерильные флаконы по 2, 5, 10 мл, герметично закрывают стерильной пластмассовой пробкой с резьбой и фасуют в потребительскую упаковку.

Пример 7. Получение препарата в форме лиофилизата

В полученные лизаты клеток добавляют защитную среду, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

В качестве защитной среды может содержать, например, сахарозо-желатиновую среду, молоко, желатозу, сахарозу, лактозу.

Пример 8. Получение препарата в таблетированной форме

Полученные лизаты клеток штамма В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами и прессуют на ротационных прессах. При формировании таблетка может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, лактозу, сахарозу, стеарат кальция, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п. На стабильность изучено 10 экспериментальных серий таблетированного препарата.

Пример 9. Получение препарата в форме суппозиториев

Полученные лизаты клеток штамма В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями и отливают на свечных машинах. При получении суппозитории или свечи в качестве наполнителя содержат, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.

На стабильность изучено 10 экспериментально-производственных серий препарата.

Пробиотик может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметилцеллюлозе, гидроксиэтилцеллюлозе, хитоне и т.п.

Пример 10. Бактерицидную активность в отношении тест-штаммов на плотных средах определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных изучаемым препаратом, измеряя зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.

Исследование показало, что наибольшие показатели бактерицидной активности были у вариантов 1А и 1Б, средние – 2А и 2Б, низкие – 3A и 3Б. При изучении бактерицидной эффективности нормоспорина вариантов 1А, 1Б, 2А и 2Б выявлено, что самые высокие показатели активности препарат проявляет в отношении грибов рода Кандида, стафилококков, энтерококков (табл.9).

Воздействие разных вариантов нормоспорина на условно-патогенные бактерии определяли методом серийных разведений в жидкой среде Гаузе 2. Выявлено, что варианты 3A и ЗБ также были менее эффективны в отношении изучаемых тест-штаммов. Показано, что нормоспорин варианты 1А, 2А, 1Б, 2Б проявляет высокий бактерицидный эффект в отношении грибов рода Кандида, энтерококка и стафилококка (табл.10).

На основании экспериментов по изучению бактерицидной активности в последующих исследованиях был использован нормоспорин в вариантах 1А и 1Б.

Изучали бактерицидную активность Нормоспорина 1А к клиническим изолятам Н.pylori. Исследования проводили методом диффузии в агар на среде Мюллер-Хинтон. Нормоспорин характеризовался высокой бактерицидной активностью в отношении исследованных тест-штаммов Н.pylori (табл.11).

Предложенный штамм Bacillus subtilis 3A депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером В.subtilis 282 (04.04.2007).

Предложенный штамм Bacillus subtilis 3A характеризуется высокой амилолитической активностью и обладает по сравнению с исходным штаммом более широким спектром антагонистической активности по отношению к болезнетворным микроорганизмам и устойчивостью к ампициллину, бензилпенициллину, азтреонаму, цефтазидиму, цефтизоксиму и полимиксину Е.

Лизаты штамма Bacillus subtilis 3A обладают бактерицидной активностью в отношении различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, энтерококков, грибов рода Кандида, хеликобактерий).

Предложенный пробиотик апробирован с положительным результатом в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии в апреле 2007 г.

Пробиотик найдет применение при лечении больных детей и взрослых при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и дисбиозов различной этиологии в лечебно-диагностических учреждениях амбулаторной и стационарной сети.

Убедительно просим экспертизу назвать предложенный пробиотик «НОРМОСПОРИН», согласно утвержденной документации.

Источники информации

1. Патент РФ 2035185, A61K 35/66, 1992 г.

2. Патент РФ 2181596, A61K 35/74, 2002 г.

Формула изобретения

Споровый препарат – пробиотик комплексного действия, включающий, мас.%:

биомасса Bacillus subtilis 282
ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)·108-1010
КОЕ в 1 мл растворителя или лизат
биомассы штамма Bacillus subtilis 282
ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)·108-1010 КОЕ
в 1 мл растворителя	92-95
наполнитель	5-8