Патент на изобретение №2387383
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ И РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ЗАБОЛЕВАНИЮ ЦИСТНЫМ ЭХИНОКОККОЗОМ У ДЕТЕЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии. Выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят HLA-типирование. При обнаружении в генотипе специфичностей DRB1*07, DQB1*09, DQB1*02 прогнозируют риск цистного эхинококкоза у обследуемого. При обнаружении специфичности DQB1*05 устойчивость к заболеванию. Использование изобретения выявляет предрасположенность и резистентность к цистному эхинококкозу у детей с высокой точностью.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска заболевания цистным эхинококкозом детей, инвазированных ленточным червем Echinococcus granulosus.
Разработанные в настоящее время методы не позволяют достоверно прогнозировать развитие эхинококкоза, поскольку имеют следующие недостатки: – клиническая диагностика болезни на ранних этапах развития патологии представляет значительные трудности, поскольку картина заболевания чаще всего отличается полиморфизмом и не имеет четких дифференциально-диагностических признаков; – диагноз эхинококкоза устанавливается инструментальными методами исследования (УЗИ, КТ, рентген) часто в запущенных случаях; – общепринятые лабораторные анализы в большинстве случаев малоспецифичны, а также недостаточно чувствительные серологические реакции; Прототипом изобретения является способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза, заключающийся в том, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1, кодирующего фермент цитохром Р450. При обнаружении в генотипе аллеля Val прогнозируют риск развития цистного эхинококкоза у обследуемого (патент RU 2324940, 2008 г.). Задачей изобретения является расширение арсенала средств для прогнозирования заболевания цистным эхинококкозом у детей. Изучение нами характера распределения специфичностей HLA у больных эхинококкозом по сравнению с группой контроля выявило статистически значимые ассоциации (р<0,05). На основании полученных результатов были определены генетические маркеры повышенного риска и устойчивости к заболеванию. Тестирование полиморфизма HLA позволило с большой вероятностью (OR>1) прогнозировать возможность клинической манифестации эхинококкоза до появления первых выраженных клинических симптомов болезни. Технический результат изобретения – получение прогностических критериев риска цистного эхинококкоза у инвазированных Е. granulosus детей на основе выявления молекулярно-генетических маркеров. Способ доступен по реактивам и оборудованию и осуществляется следующим образом. 1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисНСl (рН 7,6). 2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4 000 об/мин. 3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и суспензируют. 4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (в концентрации – 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C. Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке. 1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисНCl до рН 7,8. 2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. 3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки. 4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем – хлороформом. 5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола. 6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н2O; раствор хранят при t-20°C. В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента. OR=(a×d)/(b×c) где а – число лиц с наличием, b – с отсутствием маркера (аллеля HLA) среди больных эхинококкозом; c и d – число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых индивидов. Повышенный риск развития констатировали при OR>1. Нами были исследованы дети (N=78), больные цистным эхинококкозом, поступившие на хирургическое лечение в Республиканскую детскую клиническую больницу (г.Уфа). Возраст пациентов – от 3 до 16 лет. По половому составу распределение было следующим: 57% мальчики, 43% девочки. Поражение печени наблюдалось у 43% пациентов, легкого – 34%, сочетанное поражение легкого и печени – 23%. Диагноз был установлен на основании клинических, инструментальных (УЗИ, КТ, рентгенографии) методов и подтвержден после оперативного вмешательства гистологическим исследованием оболочки кисты. Контрольную группу составили 50 практически здоровых лиц, жителей районов Южного Урала. Возраст индивидов контрольной группы варьировал от 5 до 16 лет. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу и местожительству. Проведен молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов HLA локусов DRB1* и DQB1*. Установлено, что достоверно чаще встречаются среди больных эхинококкозом, чем среди здоровых в отношении этого заболевания детей в Башкортостане, специфичности DRB1*07 (24,7% против 14,4% в контроле, Таким образом, наличие в генотипе специфичностей HLA DRB1 *07, DQB1*09 и DQB1*02 является фактором предрасположенности. Высокий показатель отношения шансов позволяет рассматривать эти специфичности в качестве генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском цистного эхинококкоза у детей. Специфичность DQB1 *05 обладает протективным эффектом, что позволяет рассматривать его в качестве генетического маркера устойчивости. Пример 1. В Баймакском районе Республики Башкортостан (одном из наиболее неблагополучных по эхинококкозу) проведено профилактическое обследование 53 детей с использованием ультразвуковой диагностики и серологических методов (ИФА) для определения инвазированных Е. granulosus лиц. Выявлены 3 больных эхинококкозом, которые были направлены в хирургическое отделение больницы. У 17 (из 53) обследуемых детей выявлена положительная реакция ИФА (эхинококковая киста не найдена). Им проведено молекулярно-генетическое исследование полиморфизма генов HLA локусов DRB1* и DQB1 * по предложенной методике. У 4 из них обнаружены специфичности DRB1*07, DQB1*02 в генотипе, что позволило прогнозировать им повышенный риск заболевания эхинококкозом. Диспансерное наблюдение сероположительных лиц в течение года показало: эхинококковая киста малых размеров обнаружена у 3 (из 4) детей, являющихся носителями DRB1 *07, DQB1 *02. Пример 2. Девочка Л., 16 лет, поступила в хирургическое отделение с жалобами на общую слабость, периодические боли в правом подреберье, усиливающиеся при физической нагрузке. Объективно: состояние удовлетворительное; кожа и видимые слизистые бледные. В правом подреберье при глубокой пальпации определяется болезненность, живот не вздут, мягкий. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см. УЗИ органов брюшной полости выявило жидкостное, объемное образование округлой формы, расположенное в III сегменте печени размером 39×34 мм с четкими ровными контурами. Перед операцией проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем DQB1*05. В отношении эхинококкоза прогноз благоприятный. Послеоперационное исследование кисты печени показало на ее непаразитарный характер.
Формула изобретения
Способ выявления предрасположенности к цистному эхинококкозу инвазированных Е. granulosus детей, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проведение генотипирования, отличающийся тем, что проводят HLA-генотипирование и при обнаружении специфичностей DRB1*07, DQB1*09, DQB1*02 прогнозируют повышенный риск цистного эхинококкоза, а при обнаружении специфичности DQB1*05 – устойчивость к заболеванию у обследуемого.
|
||||||||||||||||||||||||||
5-6. С.5-9.). Биологическая сущность этих явлений пока только начинает изучаться.
2=4,16; р=0,04; OR=l,94), DQB1*09 (6,7% против 0,5% в контроле,