Патент на изобретение №2386699

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ Mycoplasma hominis ПО ГЕНУ РИБОСОМАЛЬНОЙ РНК

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу дифференциации штаммов бактерий Mycoplasma hominis по гену рибосомальной РНК. Дифференциацию штаммов бактерий по гену рибосомальной РНК проводят путем выделения ДНК, амплификацию участка гена проводят методом полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров MY-RES-F AGTAACACGTGCTTAATCTACCTTT и MY-RES-R CATCGCTTTCTGACAAGGTAC. Далее проводят обработку полученного амплификата рестрикционной эндонуклеазой Fsp4HI с последующим электрофорезом полученных фрагментов ДНК в агарозном геле. Затем проводят дифференциацию путем сравнения размера продуктов рестрикции с контрольными образцами ДНК. Изобретение позволяет выявлять эпидемические штаммы Mycoplasma hominis с различной степенью вирулентности.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, выявлению эпидемических штаммов и созданию на их основе перспективных вакцинных препаратов.

Среди возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовых органов особое место занимают микроорганизмы семейства Mycoplasmataceae [1], удельный вес которых, по данным ВОЗ, возрос с 28,4% до 37,6% [2]. В то же время микоплазмы являются резидентами – постоянно присутствующими представителями естественной микрофлоры урогенитального тракта.

Микоплазмами инфицировано не менее 50,0% здоровых мужчин и женщин в возрасте 30-50 лет; микоплазменная инфекция может быть причиной мужского и женского бесплодия [3, 4]. По данным других исследователей выделение микоплазм из канала шейки матки у женщин репродуктивного возраста не превышает 13,3%, при вагинитах увеличиваясь до 23,6%, и достигает 37,0% при эктопиях шейки матки [5]. Во время беременности частота обнаружения микоплазм увеличивается в 1,5-2 раза. Частота выявления Ureaplasma urealyticum у женщин репродуктивного возраста достигает 46,0% [6].

Выявлена роль колонизации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в развитии преждевременного разрыва плодных оболочек [7], повышенного риска прерывания беременности в сроке до 20 недель [8]. Показана роль М. hominis, М. genitalium и U. urealyticum в развитии хориоамнионита, эндометрита. Mycoplasma hominis может вызывать послеродовую и постабортную лихорадку, при которой микроорганизмы можно выделить из крови. Наличие в цервикальном канале уреаплазм в сочетании с повышенным титром антител к данному микроорганизму может служить маркером для выявления группы женщин с повышенным риском развития осложнений беременности (преждевременные роды и преждевременное излитие околоплодных вод) [9, 10]. Частота обнаружения U. urealyticum у женщин с привычным невынашиванием и патологией беременности составляет 40-53,0% [11].

Микоплазменные инфекции могут иметь генерализованный характер. Микоплазмы могут адсорбироваться на эпителиальных клетках урогенитального тракта, попадать в кровоток как в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), так в свободном состоянии в виде отдельных растворимых антигенов при распаде ЦИК.

Проведена сравнительная оценка диагностической ценности 6 методов (микробиологический, ПЦР, выявление антигенов в крови в реакции агрегатгемаглютинации, реакция иммунофлюоресценции, выявление антител в РПГА, ИФА) лабораторной диагностики Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum [12]. Результаты выявления возбудителей в ПЦР и РИФ были приблизительно одинаковыми (13,6 и 13,4% для Mycoplasma hominis и 44,4 и 48.8% для Ureaplasma urealyticum). Культуральным методом микроорганизмы выявляли реже 9,6% Mycoplasma hominis и 32,2% Ureaplasma urealyticum. Наиболее высокие показатели инфицированности получены при определении антигенов в крови (40,0 и 63,0% соответственно). Предложена оптимальная схема обследования пациентов: ПЦР плюс микробиологический метод, поскольку диагностикум для определения антигенов в крови (РАГА, АГ в ИФА) пока не выпускается.

Лечение микоплазменной инфекции представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам. При этом немаловажное значение имеет региональная чувствительность и резистентность возбудителя к антибактериальным препаратам [13, 14].

Представляется целесообразным перед назначением курса лечения провести тест на чувствительность выделенного штамма микоплазм к антибактериальным препаратам [15]. Хотя существует другое мнение, что определение чувствительности к антибиотикам следует проводить только при неэффективности терапии и рецидивировании процесса.

Наиболее близким решением к заявляемому является способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis по ptxSl гену, предусматривающий выделение ДНК из штаммов В. pertussis. Затем выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров S1-F2 5-CCCCCTGCCATGGTGTGATC-3 и S1-R2 5-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3 с получением ампликонов фрагмента гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина (ptxSl), которые подвергают последовательно рестрикции эндонуклеазами Ehe 1 и Bfu и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле. После этого проводят дифференциацию путем сравнения размера фрагментов ДНК штаммов В. pertussis ptxSIA, ptxSIB, ptxSID и ptxSlE аллелей гена (RU, патент 2299908, МПК C21Q 1/|68, опубл. 27.05.2007 г.) – прототип.

Данный способ – точный, ускоренный и экономически выгодный. Использование этого способа позволяет выявить эпидемические штаммы с особенностями генетической структуры ptxS1 гена и создать на их основе эффективные вакцинные препараты, обладающие высокой протективной активностью в отношении циркулирующих штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем. Однако данный метод не позволяет проводить дифференциацию штаммов Mycoplasma hominis, обладающих разной степенью вирулентности.

Задачей настоящего изобретения является выявление эпидемических штаммов Mycoplasma hominis с различной степенью вирулентности.

Технический результат данного изобретения состоит в разработке точного, ускоренного, простого и экономически выгодного способа молекулярно-генетического типирования штаммов Mycoplasma hominis.

Технический результат данного изобретения достигается тем, что в способе дифференциации штаммов бактерий по гену рибосомальной РНК, включающем выделение ДНК, амплификацию участка гена методом полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров, обработку полученного амплификата рестрикционной эндонуклеазой с последующим электрофорезом полученных фрагментов ДНК в агарозном геле и дифференциацией путем сравнения размера продуктов рестрикции с контрольными образцами ДНК, дифференцируют штаммы Mycoplasma hominis, определяют наличие мутации ТС в позиции 179 гена 16S рРНК. Амплификацию участка гена проводят с одновременным введением праймеров MY-RES-F 5 AGTAACACGTGCTTAATCTACCTTT 3 и MY-RES-R 5 CATCGCTTTCTGACAAGGTAC 3. Для рестрикционного анализа используют эндонуклеазу Fsp4HI.

Сущность изобретения основана на использовании феномена эндонуклеазной рестрикции, позволяющей различать штаммы Mycoplasma hominis, имеющие различную структуру гена, кодирующего 16S субъединицу рРНК.

При анализе нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов Mycoplasma hominis выявлена мутация – замена нуклеотида в положении 179 (тимин на цитозин), которая создает дополнительный сайт рестрикции для фермента-эндонуклеазы Fsp4HI, способной расщеплять в данном месте молекулу ДНК. Обнаружение этого факта явилось основанием для использования фермента-эндонуклеазы Fsp4HI с целью дифференциации штаммов Mycoplasma hominis, имеющих описанную мутацию, от штаммов без этой мутации.

Использование праймеров MY-RES-F 5 AGTAACACGTGCTTAATCTACCTTT 3 и MY-RES-R 5 CATCGCTTTCTGACAAGGTAC 3 для постановки ПЦР обеспечивает фланкирование участка гена 16S рРНК размером 399 пар оснований (п.о.), содержащего указанную мутацию.

Обработка продуктов ПЦР эндонуклеазой рестрикции Fsp4HI с последующим электрофоретическим разделением образовавшихся фрагментов в агарозном геле позволяет определить количество сайтов рестрикции в амплифицированном участке ДНК и размеры образовавшихся фрагментов. Для штаммов, имеющих мутацию, характерно наличие двух сайтов рестрикции и образование трех фрагментов ДНК размером 153, 144 и 102 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих мутации, продукт амплификации содержит один сайт рестрикции, вследствие чего после обработки эндонуклеазой образуются два фрагмента размером 153 и 246 п.о.

Сравнение количества и размеров образовавшихся фрагментов рестрикции с двумя контрольными образцами ДНК штаммов Mycoplasma hominis, имеющих в положении 179 гена 16S рРНК тимин или цитозин, позволяет идентифицировать штаммы, имеющие мутацию ТС в позиции 179 гена 16S рРНК.

Апробация данного способа молекулярно-генетического типирования была проведена на 20 штаммах Mycoplasma hominis, выделенных в 2006-2007 г.г.

Полученные результаты показали, что 13 штаммов Mycoplasma hominis имели в положении 179 гена 16S рРНК тимин, у 7 штаммов Mycoplasma hominis был выявлен в положении 179 гена 16S рРНК цитозин.

Из анализа научно-технической и патентной литературы совокупность признаков, обеспечивающих дифференцирование штаммов Mycoplasma hominis, основанное на использовании феномена эндонуклеазной рестрикции, не выявлена, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования является отделяемое уретры, заднего свода влагалища или цервикального канала.

Для выделения штаммов Mycoplasma hominis из исследуемого материала используют твердую питательную среду Хейфлика ЗАО НИЦФ (Санкт-Петербург). Среда Хейфлика – агаризованная питательная основа из перевара говяжьих сердец с добавлением дрожжевого экстракта, лошадиной сыворотки, насыщенного раствора холестерола, 2,5% раствора ацетата таллия, 20% раствора глюкозы, натриевой соли бензилпенициллина.

Для биохимических исследований используют тест-системы «Mycoplasma DUO» фирмы «Bio RAD». Оценку чувствительности и резистентности микоплазм к антибактериальным препаратам проводят с помощью тест-систем «Mycoplasma 1ST» фирмы «BIO-Merieux».

Пример.

Штаммы Mycoplasma hominis выращивали на среде Хейфлика. Через 72 часа после появления роста изолированных колоний отбирали 1 колонию, переносили в пробирку с 300 мкл деионизованной воды, выдерживали 15 мин при 95°С, центрифугировали при 13400 оборотов 1 мин. 10 мкл супернатанта добавляли к 20 мкл реакционной смеси, включающей следующие компоненты: 4 ед. ДНК-полимеразы (“ДиаТак”, ЦНИИ эпидемиологии, Москва), 2 mM смесь dNTP, 10 рМ каждого из двух праймеров, реакционный буфер (67 mM Трис-HCl (рН 8,3), 2,5 mM MgCl2).

ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) по следующей схеме: 1 цикл – 95°С 3 мин; 30 циклов – 95°С – 10 с, 62°С – 20 с, 72°С – 25 с; 1 цикл – 72°С – 3 мин.

Реакцию рестрикции амплифицированной ДНК проводили в течение 60 мин при 37°С. К 10 мкл реакционной смеси, содержащей следующие компоненты: 2 единицы активности рестриктазы Fsp4HI (НПО “СибЭнзим-М”, Новосибирск), буферный раствор (33 mM Tris-ацетат (рН 7.9 при 25°С); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT), прибавляли 10 мкл продукта амплификации. Реакцию останавливали нагреванием реакционной смеси до температуры 65°С в течение 20 минут.

Количество и размер фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции, определяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Гель окрашивали стандартным раствором бромистого этидия, результат реакции учитывали с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали.

Для штаммов, имеющих мутацию, характерно образование трех фрагментов ДНК размером 153, 144 и 102 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих мутации, образуются два фрагмента ДНК размером 153 и 246 п.о.

Результат данного изобретения – дифференциация штаммов Mycoplasma hominis, имеющих различную структуру гена, кодирующего 16S субъединицу рРНК.

Клинико-лабораторное обследование пациенток показало, что штаммы М. hominis, имеющие описанную мутацию, были ассоциированы с тяжелыми клиническими формами воспалительных заболеваний органов малого таза – сальпиногоофорит, эндометрит и вторичным бесплодием в 80% случаев при отсутствии других этиологических агентов заболеваний, передаваемых половым путем. Штаммы М. hominis, у которых указанная мутация отсутствовала, были выделены от пациенток с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта (вульвовагинит, эндоцервицит) без вовлечения в процесс органов верхних отделов малого таза.

Таким образом, описанный метод позволяет дифференцировать мутантные штаммы М. hominis, обладающие высокой вирулентностью.

Литература

4. – С.58-61.

3. Урогенитальный микоплазмоз. Методические рекомендации для субординаторов акушеров-гинекологов. Под редакцией Полканова B.C. / Свердловск, изд-во Свердловского медицинского института. – 1985. – 21 с.

3. – С.25-32.

1. – С.71-77.

6. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. – Нижний Новгород: Изд-во НГМА, – 2003. – С.96-119.

7. Calleri L.F., С.Taccani, A. Porcelli. Ureaplasma urealyticum vaginosis and premature rupture of membranes. What is its role? / Minerva Ginecol. – 2000. – 52: P.49-58.

8. Donders G.C., B.Van Bulck, Caudron J. et al. Relationship of bacterial vaginosis and mycoplasmas to the risk of spontaneous abortion / Am J Obstet Gynecol. – 2000. – 183: P.431-437.

9. Horowitz J. et al. Ureaplasma urealyticum cervical colonization as a marker for pregnancy complications / J.Horowitz Int J Gynaecol Obstet. 1995; 48: P.15-19.

6. – С.17-19.

4. – С.82-85.

11:2. – С.88-92.

14. Юцковская А.Я., Юцковский А.Д., Беседнова Н.Н., Курлеева Т.Ю. Чувствительность к антибиотикам Ureaplasma urealythicum, выделенных на территории Приморского края / Антибиотики и химиотерапия. – 2002. – 47:3: С.14-17.

3. – С.43-44.

Формула изобретения

Способ дифференциации штаммов бактерий Mycoplasma hominis по гену рибосомальной РНК, включающий выделение ДНК, амплификацию участка гена методом полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров, обработку полученного амплификата рестрикционной эндонуклеазой с последующим электрофорезом полученных фрагментов ДНК в агарозном геле и дифференциацией путем сравнения размера продуктов рестрикции с контрольными образцами ДНК, отличающийся тем, что амплификацию участка гена проводят с использованием праймеров MY-RES-F 5′ AGTAACACGTGCTTAATCTACCTTT 3′ и MY-RES-R 5′ CATCGCTTTCTGACAAGGTAC 3′, для рестрикционного анализа используют эндонуклеазу Fsp4HI, дифференцируют на основе наличия мутации ТС в позиции 179 гена 16S рРНК, о чем свидетельствует наличие двух сайтов рестрикции и образование трех фрагментов ДНК размером 153, 144 и 102 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих мутации, продукт амплификации содержит один сайт рестрикции, вследствие чего после обработки эндонуклеазой образуются два фрагмента размером 153 и 246 п.о.