Патент на изобретение №2167528

(54) ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP.KURSTAKI IPM-46, АКТИВНЫЙ ПРОТИВ НАСЕКОМЫХ ИЗ ОТРЯДОВ COLEOPTERA И LEPIDOPTERA

(57) Реферат:

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к защите растений, и представляет собой энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IPM-46, который может быть использован для создания инсектицидного биопрепарата. Штамм получен в результате передачи методом электропорации в клетки штамма Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73 рекомбинантной плазмиды pTV241, несущей Сrу3А-ген В. thuringiensis var. tenebrionis. Новый штамм синтезирует два инсектицидных белка: -эндотоксин Сrу3А и Cry1Ас, активные в отношении насекомых из отрядов Coleoptera и Lepidoptera. Преимущество данного штамма перед известными – высокая инсектицидная активность (110⁶ спор/мл) при расширенном спектре чувствительных к нему насекомых. Кроме представителей отряда Lepidoptera, чувствительных к -эндотоксину Cry1Ас, в этот спектр включается представитель отряда Coleoptera – колорадский жук – чувствительный к -эндотоксину Сrу3А. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, представляет собой энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki и может быть использовано в производстве препаратов против колорадского жука и других насекомых отрядов Coleoptera и Lepidoptera.

Известен штамм бактерий В. thuringiensis – продуцент -эндотоксина против колорадского жука (SU патент N 1814520, МПК A 01 N 63/00). Однако данный штамм обладает недостаточно высокой инсектицидной активностью.

Известен штамм В. thuringiensis, синтезирующий белки, токсичные для насекомых отряда Coleoptera (ЕП патент 0498537 A2, C 12 N 15/32, 1992). Однако данные токсины отличны от токсина Gry3A-типа, продуцируемого заявляемым штаммом В.thuringiensis.

Известен энтомопатогенный штамм В. thuringiensis, содержащий рекомбинантную плазмиду pTV241 с Gry3A-геном и продуцирующий Coleoptera-специфический -эндотоксин и -экзотоксин (RU заявка N 95120271/13, БИ N 6, 1998). Однако целевое применение этого штамма ограничено: он активен против представителей одного отряда – Coleoptera. Кроме того, в ряде стран запрещено производство препаратов, содержащих термостабильный -экзотоксин, так как он признан опасным для здоровья человека.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73 – продуцент Lepidoptera-специфического -эндотоксина Cry1Ac (Kronstad, J.W. & Whitely, H.R. (1984) J.Bacteriology 160, 95-102). Однако этот штамм активен только в отношении представителей отряда Lepidoptera.

Задача изобретения – создание штамма В. thuringiensis subsp. kurstaki IPМ-46, нового энтомопатогена, синтезирующего два инсектицидных белка, что расширяет спектр чувствительных к нему насекомых, представителей отряда Lepidoptera и отряда Coleoptera.

Штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IPM-46 получен в результате передачи методом электропорации в клетки штамма B. thuringiensis subsp. kurstaki HD73 рекомбинантной плазмиды pTV241, несущей cry3A-ген B. thuringiensis var. tenebrionis.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные бактерии. Вегетативные клетки – крупные подвижные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Размер клеток (1,5-1,7) (3,6-6,2) мкм. В стационарной фазе развития продуцируются белковые кристаллические включения ромбовидной и квадратной формы, образуются споры.

Культуральные признаки.

На МПА через 1 сут инкубации образуются округлые серовато-белые колонии со слабоволнистым краем, матовой мелкозернистой поверхностью, пастообразной консистенцией.

На мясопептонном бульоне, осветленной дрожжеполисахаридной среде, среде Честухиной и среде Спицайзена – образуется равномерная муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, рост возможен при 4 – 40^oC. Оптимум температуры роста 28-32^oC.

Устойчивость к антибиотикам.

Проявляет устойчивость к тетрациклину (10 мкг/мл) и хлорамфениколу (5 мкг/мл). Хранение штамма.

5-суточная культура на косяках МПА под вазелиновым маслом или в лиофилизованном состоянии.

Штамм не патогенен для теплокровных животных.

Штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IPM-46 депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Российского акционерного общества “Биопрепарат”, коллекционный N B – 1948.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ночную культуру штамма В. thuringiensis subsp. kurstaki HD73 разбавляют 1:20 свежей средой BHIG (состав: на 100 мл дистиллированной воды – 3,7 г сердечно-мозговой вытяжки и 0,5 мл глицерина) и инкубируют на качалке при 30^oC 1 ч. Культуру охлаждают в ледяной бане и все дальнейшие операции проводят, используя охлажденные растворы, посуду и т.д., центрифугируют при 3000 об/мин, 15 мин, при 4^oC, осадок однократно промывают средой УИ, содержащей 0,625 М сахарозу, 1 мМ MgCl₂. Клетки суспендируют в среде ЕВ, при этом 10-кратно концентрируют по сравнению с первоначальным объемом. К 0,55 мл суспензии добавляют 5 мкл раствора плазмидной ДНК – pTV241 с концентрацией 50 мкг/мл и смесь инкубируют на льду 5 мин. Затем смесь переносят в электродную ячейку с расстоянием между электродами 1,5 мм и проводят одиночный разряд 1500 В продолжительностью 25 мс (25 мкФ, 1000 Ом). Суспензию клеток из ячейки добавляют к 1,2 мл среды BHIG и инкубируют на качалке при 30^oC 1 ч. Затем высевают на чашки с селективной средой (МПА с 10 мкг/мл тетрациклина) и инкубируют в течение суток при 30^oC для выявления трансформантов. Тетрациклинустойчивые клоны проверяют на устойчивость к хлорамфениколу. Наличие в клетках трансформантов плазмиды pTV241 определяют с помощью электрофореза плазмидной ДНК. Приобретение трансформантами cry3A-гена подтверждают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В клетках трансформантов выявляют кристаллы ромбовидной и квадратной формы с помощью фазово-контрастной микроскопии. Продукцию трансформантами – -эндотоксинов Cry1Ac и Cry3A и ее уровень показывают и оценивают с помощью иммунологических методов: двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони и иммуноферментного анализа (РДП и ИФА).

Отбирают один трансформант и в результате получают штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IPM-46, содержащий плазмиду pTV241 и синтезирующий два -эндотоксина: Cry1Ac и Cry3A (см. таблицу).

Пример 2. Штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IPM-46 в течение суток культивируют на качалке при 30^oC в среде Честухиной следующего состава, г/л: гидролизат казеина – 5, дрожжевой экстракт – 4, NaCl – 5, глюкоза – 2, MgSO₄2H₂O – 0,1, CaCl₂2Н₂0 – 0,1. Клетки осаждают, ресуспендируют в дистиллированной воде и инкубируют на круговой качалке в течение ночи при 30^oC. Клетки при этом лизируют, высвобождая споры и кристаллы. В полученной культуральной жидкости, содержащей споры, кристаллы -эндотоксинов и небольшую примесь нелизированных вегетативных клеток, определяют титр спор и содержание -эндотоксинов Cry1Ac и Gry3A. Титр спор определяют по количеству колоний, выросших на МПА после высева разведений культуральной жидкости. Наличие кристаллов контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии. Наличие -эндотоксинов определяют в РДП, их количественное содержание – с помощью ИФА. Титр спор и количественное содержание -эндотоксинов в культуральной жидкости заявляемого штамма, а также родительского штамма В. thuringiensis subsp. kurstaki HD73 и штамма – источника cry3A гена – В. thuringiensis var. tenebrionis представлены в таблице. Данные по содержанию -эндотоксинов в культуральной жидкости указанных штаммов свидетельствуют о том, что уровень синтеза обоих -эндотоксинов в клетках заявляемого штамма не ниже, чем в каждом из приведенных для сравнения штаммов; в то же время культуральная жидкость (КЖ) представляемого штамма содержит в отличие от КЖ двух других культур оба -эндотоксина: Cry1Ac и Cry3A.

Пример 3. Биологическую активность штамма определяют в отношении личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) – тест-объекта, чувствительного к -эндотоксину Gry3A и в отношении личинок совки-гаммы (Autographa gamma) – тест-объекта, чувствительного к -эндотоксину Cry1Ac.

Оценку инсектицидной активности штамма проводят на личинках колорадского жука первого или второго возраста, отродившихся из одной популяции. Готовят серию из пяти разведений бактериальной культуры в 0,9%-ном NaCl с шагом 5. В качестве положительного контроля используют серии разведений споро-кристаллической смеси В. thuringiensis var. tenebrionis. В приготовленные суспензии опускают листья картофеля примерно одного размера, вынимают, дают им высохнуть при 20^oC и помещают в чашки Петри. В качестве отрицательного контроля используют раствор 0,9%-ного NaCl. На каждое разведение используют по 10 личинок жука и по 2-5 листьев картофеля. Учет гибели личинок проводят через 3 суток инкубирования в термостате при 21^oC и фотопериоде 18 ч.

Биологическую активность штаммов, выраженную в ЛК₅₀, вычисляют по формуле Кербера в величинах концентрации спор в разведениях бактериальной культуры:
lg ЛК₅₀ = lgC_м– (L – 0,5),
где C_м – максимальная из испытанных концентраций;
– логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведения);
L – сумма значений L (доли погибших личинок от числа испытуемых), найденных для всех концентраций с учетом поправки на гибель в контроле по методу Аббота:
L=(p_о-p_k):(1-p_k),
где p_o – доля погибших личинок при испытании культуры;
p_k – доля погибших личинок в контрольном опыте.

Биологическая активность в отношении личинок колорадского жука заявляемого штамма составляет 1 10⁶ спор/мл, контрольного штамма – 6,1 10⁶ спор/мл.

Биологическую активность штамма в отношении личинок совки-гаммы (Autographa gamma) определяют по методу, аналогичному описанному выше, за исключением того, что в случае совки-гаммы используют листья фасоли.

Полученные результаты аналогичны результатам третьего примера.

Сравнительные данные по содержанию -эндотоксинов и инсектицидной активности в клетках предлагаемого штамма и штаммов-источников cry-генов представлены в таблице.

Из данных, представленных в таблице, видно, что предлагаемый штамм синтезирует оба -эндотоксина, и его инсектицидная активность в отношении колорадского жука в 6 раз выше, чем активность В. thuringiensis var. tenebrionis.

Биоиспытания, проведенные на чувствительных к Cry1Ac -эндотоксину совках гамма (Autographa gamma L.), показали результаты на уровне прототипа. Таким образом, предлагаемый штамм активен в отношении обоих тест-объектов, что расширяет спектр возможного применения предлагаемого штамма в качестве средства защиты растений.

Формула изобретения

Штамм Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73 IPM-46, содержащий рекомбинантную плазмиду pTV241 – продуцент -эндотоксинов, активный против насекомых отрядов Coleoptera и Lepidoptera.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 20.10.2006

Извещение опубликовано: 20.01.2008 БИ: 02/2008