Патент на изобретение №2386448

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Способ включает раздельное выращивание эшерихий, стафилококков, протея и синегнойной палочки на унифицированной жидкой синтетической среде, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты – 8,0; аспарагина – 1,0; хлористого натрия – 7,0; сернокислого цинка – 0,2; сернокислого магния – 0,4; сернокислого железа – 0,2; фосфорно-кислого калия 2-зам. – 3,0; глицерина – 40 мл с рН 7,5±0,1. При этом стафилококки выращивают до 10±2,0 млрд/мл в течение 10-12 суток, эшерихий – до 60±10 млрд/мл в течение 2-3 суток, протей и синегнойную палочку – до гомогенной слизеподобной взвеси. Затем проводят стерилизацию при 1,0 атм в течение 20-30 минут, детоксикацию токсинов двумя детоксикаторами – первоначально 0,2% раствором формалина при 42°С в течение 5-6 суток, а затем 0,5% раствором этония при 45°С в течение 6-7 суток. Полученные препараты смешивают в равных объемах с последующей сорбцией на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия, фасуют по флаконам и стерилизуют в течение 30 минут при 100°С. Анатоксин-вакцина обладает высокой эффективностью при профилактике и лечении гнойно-септических заболеваний.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к изготовлению биопрепаратов для профилактики и лечения гнойно-септических болезней.

Известные способы получения анатоксинов, инактивированных вирусных и бактерийных вакцин основаны на использовании для детоксикации выращенных микроорганизмов и их токсинов 0,8±0,2% раствором формалина.

Особое внимание при производстве инактивированных анатоксин-вакцин обращено на разработку синтетических питательных сред для выращивания микроорганизмов, поиск оптимальных безвредных детоксикаторов и замену ртутьсодержащих консервантов типа мертиолята.

Это связано с тем, что формалин не обеспечивает полноту детоксикации всего комплекса бактерийных токсинов и, особенно суперэнтеротоксинов, и его способностью с мертиолятом вызывать аллергизацию организма, денатурацию белков и онкогенные процессы.

Поэтому необходимы исследования по повышению эффективности синтетических питательных сред взамен мясо- и казеиногидролизатных, содержащих балластные вещества мяса, казеина, пептона, и в направлении безвредности детоксикаторов.

Производство существующих колибактериозных, стафилококковых, протейных и синегнойных анатоксин-вакцин основано на применении для выращивания микроорганизмов мясопептонных или казеинопептонных бульонов и использовании для детоксикации токсинов формалина и консерванта мертиолята.

Несмотря на то что мертиолят как ртутьсодержащий консервант в биологической промышленности используется с 1930 года, в соответствии с современными требованиями отдается предпочтение комбинированным препаратам, свободным от консерванта. Прогресс последнего времени позволяет производственникам получать вакцины, содержащие 6 и более антигенов для вакцинации животных и даже детей младшего возраста (чума, рожа, пастереллез, болезнь Ауески и т.д., дифтерия, столбняк, коклюш, гемофильная и гепатитная вакцины).

Изучено, что гнойно-воспалительные заболевания, вызываемые стафилококками, протеями, псевдомонами, клебсиелами, эшерихиями и их ассоциациями, составляют свыше 50% у больных дерматитами, маститами, хирургической патологией (Хватов В.Б., Биткова У.У. и др. Сравнительное изучение этиологической значимости возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. ЖМЭИ, 2002, 5. С.35-38).

Однако отсутствие рациональных синтетических питательных сред для выращивания указанных микроорганизмов, методов и средств детоксикации их токсинов сдерживает разработку комбинированной вакцины.

Известны способ специфической профилактики с помощью убитой ассоциированной вакцины, включающий протейные, стафилококковые и синегнойные антигены (Воробьев А.А. Микробиология и иммунология. М. «Медицина», 1999, с.425-432); «Способ получения синегнойной вакцины на основе антигенов, выделенных из супернатанта среды культивирования» (Нуриддинова Н.Р., Иванова Л.Е. ЖМЭИ, 2002, 4. С.40-44); «Способ получения формолтиомерсаловой вакцины против колибактериоза телят, поросят» (Осидзе Д.Ф., Борисович Ю.Ф., Кирилов Л.В. Биопрепараты. Изд-во «Колос», 1981, с.220-225) и «Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины» (Евглевский Ан.А. Патент 2229893 от 10 июня 2004 года).

Недостатком указанных способов является выращивание стафилококков, эшерихий, протея и синегнойной палочки на мясо-, казеиногидролизатных средах с пептоном, применение высокой концентрации формалина до 0,8±0,2% для детоксикации токсинов и ртутьсодержащего консерванта мертиолята.

Для устранения указанных недостатков предлагается способ получения ассоциированной анатоксин-вакцины с использованием оптимальной синтетической среды с глицерином, пригодной для выращивания стафилококков, эшерихий, протея и синегнойной палочки, проведением полной детоксикации комплекса токсинов двумя детоксикаторами – первоначально 0,2% раствором формалина при 42°С в течение 5-6 суток, а затем 0,5% раствором этония при 45°С в течение 6-7 суток.

Целью предлагаемого изобретения является получение безопасной ассоциированной анатоксин-вакцины для профилактики гнойно-септических заболеваний раздельным выращиванием микроорганизмов на унифицированной синтетической среде, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты – 8,0; аспарагина – 1,0; хлористого натрия – 7,0; сернокислого цинка – 0,2; сернокислого магния – 0,4; сернокислого железа – 0,2; фосфорно-кислого калия 2-зам. – 3,0; глицерина – 40 мл с последующим установлением реакции среды до 7,5±0,1 – 5-10% раствором аммиака перед автоклавированием, обеспечивающей стабильное накопление эшерихий в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, в течение 2-3 суток до 60±10 млрд/мл, стафилококков при культивировании в течение 10-12 суток до 10±20 млрд/мл, протея и синегнойной палочки при выращивании в течение 2-3 суток до образования гомогенной слизеподобной взвеси с сероватой пленкой на поверхности среды, проведением детоксикации комплекса токсинов поочередно двумя детоксикаторами – 0,2% раствором формалина при 42°С в течение 5-6 суток, а затем 0,5% раствором этония при 45°С в течение 6-7 суток, смешиванием равных объемов вакцин, сорбцией на гидроксиде алюминия, расфасовкой препарата по флаконам и стерилизацией при 100°С в течение 30 минут.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому, с использованием этония, что свидетельствует о новизне предлагаемого решения.

Применение унифицированных синтетических сред, пригодных для выращивания стафилококков, протея, эшерихий и синегнойной палочки, и двух детоксикаторов для полной детоксикации комплекса токсинов позволяет получить безвредную и эффективную ассоциированную анатоксин-вакцину.

Максимальное накопление микроорганизмов на разработанной синтетической среде и обеспечение полной детоксикации всего комплекса токсинов двумя детоксикаторами – при изъятии ртутьсодержащего консерванта мертиолята – позволяет определить рациональный технологический режим получения ассоциированной вакцины.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения ассоциированной анатоксин-вакцины для профилактики и лечения гнойно-септических болезней

Для выращивания микроорганизмов используют жидкую синтетическую среду следующего состава в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты – 8,0; аспарагина – 1,0; хлористого натрия – 7,0; сернокислого цинка – 0,2; сернокислого магния – 0,4; сернокислого железа – 0,2; фосфорно-кислого калия 2-зам. – 3,0; глицерина – 4 – мл.

Для осуществления способа использовались свежевыделенные патогенные штаммы эшерихий (Escherichia coli), стафилококков (Staphylococcus aureus), протея (Proteus vulgaris) и синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), а также лабораторные культуры перечисленных видов, полученные из Курской областной ветеринарной лаборатории и с кафедры микробиологии и вирусологии Курского государственного медицинского университета.

Выращенные раздельно на синтетической питательной среде вышеуказанного состава в 2-х литровых биобутылях с объемом среды до 1 литра: стафилококки – в течение 12 суток до 10±2,0 млрд микробных клеток на 1 мл взвеси, кишечная палочка – в течение 3 суток до 70 млрд/мл взвеси, протей и синегнойная палочка – до гомогенной слизеподобной взвеси микроорганизмов – подвергнуты автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут, а затем детоксикации 0,2% раствором формалина в течение 5 суток при 42°С и 0,5% раствором этония при 45°С в течение 7 суток. После завершения детоксикации проводят смешивание в равных объемах 4-х видов анатоксин-вакцин и сорбцию на гидроксиде алюминия из расчета 3 мг/мл, расфасовку препарата по флаконам и стерилизацию при 100°С в течение 30 минут.

Пример 2. Испытание вакцины на безвредность проводили путем двукратного подкожного введения с интервалом 7 суток белым мышам в объеме 0,3 мл (8 гол.), кроликам (6 гол.), морским свинкам (6 гол.), курам (6 гол.) – по 5-6 мл и щенкам (4 гол.), поросятам (8 гол.) – по 7 мл.

Наблюдение за животными в течение 10-12 суток не выявило клинических изменений и гнойно-воспалительных процессов в местах введения препарата. Все животные остались живыми.

Пример 3. Испытание вакцины на активность проводили на указанных животных, которые были использованы при проверке на безвредность путем подкожного заражения смесью взвеси вирулентных 1-2-суточных бульонных культур стафилококков (2,0 млрд/мл), эшерихий (2,0 млрд/мл), протея (2,0 млрд/мл) и синегнойной палочки (1 млрд/мл) в объеме 0,5-1,0 мл.

При наблюдении в течение 12-15 суток у животных не было отмечено развития септических процессов, образования абсцессов и проявления диарейных синдромов.

Пример 4. Испытание лечебно-профилактической активности вакцины при лечении гнойно-некротических ожоговых поражений кожи у поросят и собак

Ожоговые поражения кожи у 6 поросят и 7 собак вызывали с помощью 5% раствора фенола путем приложения смоченной марли на 2-3 минуты. Лечение ожоговых поражений кожи проводили путем 2-3-кратного орошения в сутки вакциной марлевых повязок. В целом, заживление пораженных участков кожи в диаметре 7-10 см у животных происходило за 20-25 суток.

Пример 5. Изучение эффективности вакцины при лечении дерматитов у 18 собак и 12 кошек проводили путем 2-3-кратного в сутки орошения пораженных участков кожи. Эффективность лечения проявилась через 7-12 суток без рецидива.

Пример 6. Испытание вакцины при лечении гнойно-катаральных маститов у 24 коров проводили путем интрацистернального введения вакцины по 3-5 мл в каждый сосок вымени.

Выздоровление коров происходило в целом за 5-6 суток, а при использовании мастисана-А через 7-9 суток.

Формула изобретения

Способ получения ассоциированной анатоксин-вакцины, включающий раздельное выращивание эшерихий, стафилококков, протея и синегнойной палочки на унифицированной жидкой синтетической среде, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты – 8,0; аспарагина – 1,0; хлористого натрия – 7,0; сернокислого цинка – 0,2; сернокислого магния – 0,4; сернокислого железа – 0,2; фосфорно-кислого калия 2-зам. – 3,0; глицерина-40 мл с рН 7,5±0,1: стафилококков до 10±2,0 млрд/мл в течение 10-12 суток, эшерихий до 60±10 млрд/мл в течение 2-3 суток, протея и синегнойной палочки до гомогенной слизеподобной взвеси, стерилизацию при 1,0 атм в течение 20-30 мин, детоксикацию токсинов двумя детоксикаторами – первоначально 0,2%-ным раствором формалина при 42°С в течение 5-6 суток, а затем 0,5%-ным раствором этония при 45°С в течение 6-7 суток, смешивание равных объемов вакцин, сорбцию на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл, расфасовку препарата по флаконам и стерилизацию при 100°С в течение 30 мин.