Патент на изобретение №2386120

(54) ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОЗДУХЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, в частности, фосфорорганическими инсектицидами и карбаматами. Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе включает оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного на нейтральной подложке комплекса, включающего холинэстеразу и флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор» (MR), который интенсивно флуоресцирует с этим ферментом в составе комплекса ацетилхолинэстераза-молекулярный ротор. В качестве флуорогенного индикатора используют тиофлавин Т, интенсивность флуоресценции которого в присутствии ацетилхолинэстеразы увеличивается более чем в 1000 раз. Кроме того, ускоряется необратимое ингибирование ацетилхолинэстеразы, вследствие чего биосенсор по изобретению является более чувствительным к необратимым ингибиторам, в том числе и к ингибиторам холинэстеразы. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды, в частности, фосфорорганическими инсектицидами и карбаматами.

Высокая токсичность и кумулятивное действие многих фосфорорганических ингибиторов (ФОИ) холинэстеразы (ChE) обусловливают актуальность создания чувствительных технических средств, предназначенных для мониторинга окружающей воздушной среды на наличие ингибиторов ChE.

В полевых условиях целесообразно использование для определения ингибиторов ChE наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации аналитических технических средств типа биосенсор – устройства, состоящего из активного компонента и преобразователя аналитического эффекта в регистрируемый сигнал (световой, звуковой и т.п.). Активный компонент биосенсора (БС) играет, в основном, роль «узнающего» агента, который специфически взаимодействует с определяемым веществом, например фермент – субстрат, фермент – ингибитор и др. Этой роли хорошо соответствует ChE, отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к ее ингибиторам. Для преобразования аналитического эффекта в информационный сигнал используют, как правило, оптические схемы.

Из оптических БС наибольшей чувствительностью к ФОИ отличаются БС, основанные на регистрации в качестве аналитического отклика флуоресценции. Известны оптические БС определения ингибиторов ChE, основанные на использовании флуоресцентной метки, являющейся обратимым ингибитором ChE [1, 2]. Например, для анализа проб воды в качестве активного компонента оптического БС используется комплекс ацетилхолинэстеразы (AChE) и флуоресцеинизоцианата (FITC), иммобилизованный на волокнах кварца [1]. Активность AChE контролируют по рН-зависимости флуоресцентного сигнала комплекса FITC-AChE, иммобилизованого на поверхности волокна. В результате ферментативного гидролиза субстрата (ацетилхолина) ацетилхолинэстеразой образуются протоны, которые ингибируют AChE, меченную FITC, и это вызывает тушение флуоресценции реакционного раствора. Обратимые ингибиторы эдрофониум и карбамат неостигмин в концентрации 0.1 мМ ингибируют AChE, меченную FITC, что ведет к уменьшению степени тушения флуоресценции. Степень снижения интенсивности флуоресценции обратно пропорциональна концентрации этих ингибиторов. Такой БС определяет концентрации ФОИ (эхотиофат и параоксон) в интервале нМ-мкМ.

Недостатком данного БС является его низкая специфичность, высокая чувствительность к кислым реагентам, которые могут присутствовать в анализируемом воздухе и, таким образом, вносить определенную погрешность в результаты анализа. Перечисленные недостатки такого БС не дают возможность использовать его для определения ингибиторов ChE в воздушной среде и проведения мониторинга.

Наиболее близким к предлагаемому аналитическому устройству является оптический БС для определения ингибиторов ChE в воздухе, активный компонент которого выполнен из комплекса этого фермента с обратимым ингибитором-люмогеном I_f, иммобилизованного на нейтральной подложке [2]. Интенсивность флуоресценции I_f, например N-метилакридина, снижается при воздействии ChE, что обусловлено образованием нефлуоресцирующего фермент-ингибиторного комплекса [ChE-I_f]. В свою очередь, при воздействии нефлуоресцирующего необратимого ингибитора I_n, например O,O-диизопропилфторфосфата, наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции. Наблюдаемый эффект обусловлен фосфорилированием ChE с высокой скоростью, что ведет к смещению равновесия в сторону диссоциации комплекса [ChE-I_f], увеличению концентрации свободного обратимого флуорофора-ингибитора I_f и, как следствие, к увеличению интенсивности флуоресценции реакционного раствора. Преимуществом данного БС является несущественное влияние повышенной кислотности атмосферного воздуха благодаря использованию в активном компоненте буфера с высокой буферной емкостью.

Однако этот БС не отвечает современным требованиям по чувствительности. Данный БС принят в качестве прототипа.

Предлагаемое решение направлено на увеличение чувствительности БС к ингибиторам ChE.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом БС активный компонент представляет собой иммобилизированный на подложке интенсивно флуоресцирующий комплекс, образованный AChE и флуорогеном из группы индикаторов типа “молекулярный ротор” (MR). Известен ряд таких флуорогенов MR, например пропидиум, галламин, тиофлавин Т (ТФ) и др. [3], интенсивность флуоресценции которых, например ТФ, увеличивается в присутствии AChE на два-три порядка [3]. При воздействии ФОИ на активный компонент происходит снижение интенсивности флуоресценции комплекса [AChE-ТФ] пропорционально концентрации необратимого ингибитора. В то же время установлено увеличение скорости ингибирования AChE фосфорорганическими ингибиторами в присутствии некоторых MR, например пропидиума или ТФ. Эти свойства MR позволили предложить в качестве активного компонента БС использовать комплекс [AChE-MR], отличающийся более высокой чувствительностью и меньшим временем отклика аналитического эффекта к необратимым ингибиторам ChE по сравнению с активным компонентом БС прототипа.

Кроме того, в оптическую часть БС предлагается внести лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель, что позволит увеличить чувствительность БС в целом.

Конструкция оптической части БС представлена на чертеже в виде блок-схемы.

Пример. Изготовление активного компонента

Использовались следующие реактивы фирмы “Sigma”: ацетилхолинэстераза угря, тиофлавин Т, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, параоксон, N-изопропилакриламид, N,N’-метилен-бисакриламид.

Иммобилизацию комплекса АХЭ с тиофлавином проводили в 0.03 М трис-HCI буфере (рН 7) при 4°С.

В 1 мл 0.03 М трис-HCI буфера (рН 7), содержащего 200 мг N-изопропилакриламида, АХЭ (20 Е/мл) и 1 мМ тиофлавина, добавляли при 4°С и перемешивании 0.02 мл раствора N,N’-метилен-бисакриламида (18 мг/мл), наносили на поверхность нейтральной полимерной пленки и проводили полимеризацию в течение 20 мин при УФ-облучении.

Анализ результатов определения необратимого ингибитора параоксона биосенсором-прототипом и предлагаемым биосенсором приведен таблице 1.

Из представленных в таблице 1 данных следует, что чувствительность к параоксону предложенного активного компонента существенно выше, чем прототипа.

Таким образом, активный компонент биосенсора на основе иммобилизированного на подложке интенсивно флуоресцирующего комплекса, образованного AChE и флуорогеном из группы индикаторов типа “молекулярный ротор” (MR), позволяет повысить интенсивность флуоресценции на два-три порядка и обладает способностью ускорять необратимое ингибирование AChE, что позволило сконструировать БС, более чувствительный к необратимым ингибиторам, в том числе и фосфорорганическим ингибиторам, по сравнению с БС прототипом.

В таблице 2 сопоставлены существенные признаки БС прототипа и предлагаемого БС.

Таблица 2.
Существенные признаки биосенсора прототипа и предлагаемого биосенсора
п/п	Существенные признаки	Биосенсор-прототип	Предлагаемый биосенсор
1	Активный компонент	Комплекс холинэстеразы с люмогеном-ингибитором, иммобилизованный на нейтральной подложке	Комплекс холинэстеразы с индикатором типа “молекулярный ротор”, иммобилизованный на нейтральной подложке, вызывает увеличение интенсивности флуоресценции на два-три порядка
2	Время отклика	Состав активного компонента не позволяет дополнительно сократить время отклика биосенсора	Состав активного компонента позволяет сократить время отклика биосенсора за счет увеличения скорости необратимого ингибирования
3	Оптический датчик	Классическая оптическая схема определения флуоресценции	Предлагается использовать лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель для повышения стабильности и чувствительности детектирования флуоресценции

Использованные литературные источники

1. Rogers K.R, Сао С.J, Valdes J.J, Eldefrawi A.T, Eldefrawi M. E. Fundam Appl Toxicol 1991. v.16, p.810-20.

2. Патент РФ 2198394, 18.12.2003. МПК⁷ C12Q 1/46, G01N 21/76.

3. De Ferrari G.V., Mallender W.D., Inestrosa N.C., Rosenberry T.L. J.Biol. Chem. 2001. v.276, p.23282-23287.

Формула изобретения

1. Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе, включающий оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного на нейтральной подложке комплекса, отличающийся тем, что указанный комплекс представляет собой интенсивно флуоресцирующий комплекс, включающий холинэстеразу и флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор».

2. Оптический биосенсор по п.1, отличающийся тем, что флуорогенный индикатор типа «молекулярный ротор» представляет собой тиофлавин Т.

3. Оптический биосенсор по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что он включает лазерный источник света для возбуждения активного компонента, модулятор и синхронный усилитель.

РИСУНКИ