Патент на изобретение №2384844

(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛОВУШЕК

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к иммунологии. Предложен способ обнаружения нейтрофильных ловушек. Производят окрашивание акридиновым оранжевым фиксированной на стекле взвеси нейтрофилов, выделенных из периферической венозной крови человека и активированных различными микроорганизмами. Полученный препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Способ позволяет ускорить и упростить выявление нейтрофильных ловушек и дать количественную характеристику их образования. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для обнаружения нейтрофильных ловушек экспресс-методом с количественной оценкой данного явления.

Известен способ обнаружения сетеподобных внеклеточных структур нейтрофилов с использованием метода сканирующей электронной микроскопии [5]. Авторы использовали для визуализации образовавшихся структур. Однако данный способ обнаружения нейтрофильных ловушек требует наличия специального оборудования, набор реактивов для приготовления препарата и очень аккуратного выполнения исследования, так как образующиеся структуры очень хрупкие и быстро разрушаются при механическом воздействии [5].

Для определения нейтрофильных ловушек, которые являются по своей сути волокнами ДНК, можно использовать метод выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена [4]. Данная реакция требует фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10%-ном забуференном формалине, для приготовления реактивов используются агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждаются в специальных условиях хранения. Кроме того, реакция проходит в 2 этапа, которые занимают около 2-2,5 часов. При соблюдении всех условий ядерное вещество окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводят с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении ×1000. Однако даже при соблюдении всех требований выполнения данной реакции учет представляет определенные сложности: при световой микроскопии не всегда удается рассмотреть тонкие, внеклеточно расположенные волокна ДНК активированных нейтрофилов, а бактерии-активаторы не определяются.

Предлагаемый способ значительно упрощает подготовку препарата, окраску и визуализацию хроматина.

Целью заявляемого способа является оптимизация выявления нейтрофильных ловушек и их количественная оценка.

Сущность предлагаемого способа заключается в использовании раствора акридинового оранжевого для окраски ядерного вещества фиксированных нейтрофилов, выделенных из периферической венозной крови человека и активированных различными микроорганизмами.

Предлагаемый способ диагностики соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов обнаружения ловушек обладает следующими существенными отличительными признаками:

– исследуемый материал фиксируется 96%-ным этиловым спиртом;

– для окраски используется один реактив (акридиновый оранжевый);

– учет проводят с помощью люминесцентной микроскопии, позволяющей четко различать окрашиваемые структуры (ядра нейтрофилов окрашивается в ярко-зеленый цвет, цитоплазма клеток, сохранивших морфологию, не окрашивается, нейтрофильные ловушки представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет);

– позволяет количественно охарактеризовать данное явление.

Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

1. Взвесь нейтрофилов получают, используя 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивают в стерильной пробирке при температуре +37°С в течение 30 минут. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего – 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотах в минуту на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут и доводят до концентрации 5·10⁶ клеток/мл [1, 3].

2) Полученную взвесь клеток инкубируют при температуре +37°С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных штаммов (S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17) (препарат “Колибактерин”), Lactobacterium spp.(препарат Лактобактерин сухой), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1 мл (по стандартному мутности БАК-10) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий, содержащей 10⁸ Lactobacterium spp., 10⁶ Bifidobacterium spp., 10³S. aureus, 10³E. coli в 1 мл на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для контроля используют взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях, но без активаторов [1].

3) После инкубации клеточную взвесь наносят на стекло и высушивают.

4) Для фиксации используют 96%-ный этиловый спирт, который наносят на мазок в количестве 100 мкл, после испарения спирта мазок считают фиксированным.

5) Для окрашивания нейтрофильных ловушек на фиксированный препарат наносят 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 минут в темноте. Раствор акридинового оранжевого готовят предварительно по следующей схеме: 5 мг сухого красителя растворяют в 5 мл физиологического раствора, полученный таким образом маточный раствор (1 мг/мл) хранят при Т=4°С. Перед использованием 0,2 мл раствора смешивают с 4,8 мл физиологического раствора, получая рабочий раствор

6) Учет проводят с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм, и эмиссию с длиной волны 520 нм. Ядра нейтрофилов окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет.

При этом можно провести количественную оценку образования ловушек, так как при таком способе окраски хорошо различима морфология нейтрофилов: 1 группа объединяет клетки с сегментированным ядром, 2 группа включает клетки с недифференцированным ядром, и к 3 группе относят свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки). Проводят подсчет 100 структур разных групп и определяют процентное содержание каждой морфологической единицы.

При предлагаемом способе окраски можно оценить как активность и интенсивность поглощения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, так и показатели попадания бактерий-активаторов в нейтрофильные ловушки, так как имеется хороший контраст между нейтрофилами, их ловушками, окрашиваемыми в зеленый цвет, и бактериями, окрашиваемыми в оранжевый. Для этого рассчитывают следующие показатели:

1) активность фагоцитоза (%) – число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме из 100 подсчитанных клеток с сегментированным ядром;

2) интенсивность фагоцитоза (усл.ед.) – число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку;

3) число нейтрофильных ловушек (%) – количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур;

4) индекс нейтрофильной ловушки (усл.ед.) – число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 структуру.

Предлагаемым способом окрашено 50 фиксированных препаратов, из которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль) и 4 группы по 10 мазков были приготовлены из взвеси нейтрофилов, активированных E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp.или смесью бактерий соответственно (таблица 1, 2).

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [2].

Приводим примеры использования предлагаемого способа обнаружения нейтрофильных ловушек.

Пример 1

Окраске подвергались нейтрофилы, выделенные из периферической крови здоровой женщины Е., 31 год и активированные E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные сети ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание ловушек после взаимодействия с E. coli составило 44%, с S. aureus – 20%, с Lactobacterium spp.- 49% и со смесью бактерий – 26%) и оценить индекс нейтрофильной ловушки (после взаимодействия с E. coli индекс попадания бактерий в нейтрофильную ловушку составил 8,72, с S. aureus – 9,12, с Lactobacterium spp. – 2,02 и со смесью бактерий – 1,07).

Пример 2

Окраске подвергались нейтрофилы, выделенные из периферической крови здоровой женщины К., 19 лет и активированные E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные сети ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание ловушек после взаимодействия с E. coli составило 30%, с S. aureus – 45%, с Lactobacterium spp. – 20% и со смесью бактерий – 32%) и оценить индекс нейтрофильной ловушки (после взаимодействия с E. coli индекс попадания бактерий в нейтрофильную ловушку составил 4,5, с S. aureus – 5,11, с Lactobacterium spp. – 5,75 и со смесью бактерий – 1,0).

Пример 3

Окраске подвергались нейтрофилы, выделенные из периферической крови здоровой женщины Г., 23 года и активированные E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные сети ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание ловушек после взаимодействия с E. coli составило 32%, с S. aureus – 30%, с Lactobacterium spp. – 19% и со смесью бактерий – 13%) и оценить индекс нейтрофильной ловушки (после взаимодействия с E. coli индекс попадания бактерий в нейтрофильную ловушку составил 4,56, с S. aureus – 11,8, с Lactobacterium spp. – 0,78 и со смесью бактерий – 0,69).

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет оптимизировать выявление нейтрофильных ловушек и количественно охарактеризовать данное явление.

Таблица 1
Содержание различных морфологических форм нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после взаимодействия E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий (n=10), %
Показатели	Нейтрофилы
НН	AHE	AHS	AHL	АН смесью бактерий
Содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, %	59,89±6,19	32,40±5,38*	40,70±2,21*	28,40±4,81*	56,33±6,59
Содержание нейтрофилов с недифференцированным ядром, %	24,11±3,47	31,30±2,31*	32,9±4,72	37,10±3,83*	15,33±1,63
Содержание ловушек, %	16,0±4,22	36,30±3,89*	30,00±2,73*	34,50±4,50*	28,33±5,15*
Примечание к таблице 1: * – достоверность различий показателей по отношению к НН;
НН – неактивированных нейтрофилов;
АНЕ – нейтрофилы, активированные E. coli (штамм М-17);
AHS – нейтрофилы, активированные S. aureus (штамм 209);
AHL – нейтрофилы, активированные Lactobacterium spp.;
АН смесью бактерий – нейтрофилы, активированные смесью бактерий.
Таблица 2
Показатели фагоцитоза и содержание E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp.в нейтрофильных ловушках (n=10)
Показатели	Активирующие агенты
E. coli	S. aureus	Lactobacterium spp.	смесь бактерий
Активность фагоцитоза, %	76,00±6,49*	84,00±3,39*	34,5±4,5*	21,22±2,85
Интенсивность фагоцитоза на 1 клетку, усл. ед	2,59±0,56*	8,49±1,08*	1,22±0,40	0,36±0,05
Индекс нейтрофильной ловушки, усл. ед	5,91±0,50*	11,52±1,18*	2,56±0,56*	0,93±0,21
Примечание к таблице 2: * – достоверность различий показателей по отношению к показателям нейтрофилов, активированных смесью бактерий

Литература

1. Андреева Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин: дис. канд. мед. наук / Ю.С.Андреева. – Челябинск, 2005. – 150 с.

2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С.Гланц. – М.: Практика, 1999. – 450 с.

3. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И.Долгушин, О.В.Бухарин. – Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2001. – 288 с.

4. Меркулов, Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А.Меркулов. – МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 1956. – 263 с.

Формула изобретения

Способ обнаружения нейтрофильных ловушек в клеточной взвеси, отличающийся тем, что фиксированный препарат окрашивают 200 мкл акридинового оранжевого в концентрации 0,2 мг/мл в течение 2 мин, учитывают с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм, обнаруживают ядра нейтрофилов, которые окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки, представленные тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, и бактерии-активаторы ярко-оранжевого цвета, проводят подсчет 100 структур разных групп и рассчитывают процентное содержание каждой морфологической единицы, при наличии в мазках нейтрофилов с сегментированным ядром оценивают активность фагоцитоза (%) – число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме из 100 подсчитанных клеток с сегментированным ядром и интенсивность фагоцитоза (усл. ед.) – число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку, при обнаружении сетеподобных структур оценивают число нейтрофильных ловушек (%) – количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур и индекс нейтрофильной ловушки (усл. ед.) – число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 структуру.