(21), (22) Заявка: 2008128744/13, 14.07.2008
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
14.07.2008
(46) Опубликовано: 20.03.2010
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске:
RU 2233886 C1, 10.08.2004. RU 2233883 C1, 10.08.2004.
Адрес для переписки:
400131, г.Волгоград, ул. Голубинская, 7, ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора
|
(72) Автор(ы):
Буланцев Александр Леонидович (RU), Алексеев Владимир Валерьевич (RU), Липницкий Анатолий Васильевич (RU), Дандина Ольга Владимировна (RU)
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (RU)
|
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ СТРЕПТОМИЦИНА С ПОМОЩЬЮ СПОРОВО ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ШТАММА Bacillus anthracis Davies “R” БАЛ 31 StrD В ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ, БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ И ЖИДКОСТЯХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предварительно получают на градиентные пластинки Str 25 мкг/мл споры авирулентного бесплазмидного штамма в трех вариантах а, b, c с различным уровнем стрептомицинзависимости, а затем с помощью этих вариантов определяются степени зависимости этих трех вариантов в исследуемом объекте, содержащем остаточную активность стрептомицина. Настоящее изобретение позволяет определять активность (концентрацию) стрептомицина в питательной среде в биологических тканях и жидкостях. 3 ил.
Способ определения остаточной активности стрептомицина с помощью спорово тест-культуры штамма Bacillus anthracis Davies “R” БАЛ 31 StrD в питательных средах.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается определения остаточной активности антибиотиков в исследуемых объектах.
В России ежегодно регистрируется случаи заболевания людей и животных сибирской язвой [1].
Особую актуальность возбудителей сибирской язвы приобрел как агент биологического оружия, поскольку споры Bacillus anthracis обладают чрезвычайно высокой устойчивостью к воздействию различных факторов, а также имевшее место загрязнение спорами возбудителя сибирской язвы почтовых зданий и других помещений в США и последовавшая при этом гибель людей подтвердили высокую вероятность использования спор В.anthracis в качестве биологического оружия при проведении биотеррористических актов [2].
Ведущее место при экстренной профилактике и лечении сибирской язвы принадлежит антибиотикам широкого спектра действия, таким как стрептомицин или его сочетаниям с другими лекарственными средствами [3, 4].
Однако широкое применение антибиотиков (в том числе и стрептомицина) создает серьезные проблемы, в частности формирование лекарственно-устойчивых штаммов бактерий.
Появление в популяции В.anthracis клонов, устойчивых к антибиотику, представляет серьезную проблему в лечении и экстренной профилактики сибиреязвенной инфекции.
Комитет экспертов ВОЗ одобрил два определения устойчивости бактерий к лекарственным препаратам [5]. Первое из них ориентируется на потребление клиники. Микроорганизм признается устойчивым, если он может переносить действие препарата в концентрации, которая превышает возможный уровень его содержания в тканях организма. Второе определение имеет бактериологическую направленность. Микроорганизм признают устойчивым, если он переносит действие препаратов более высокой концентрации, чем другие штаммы микроорганизма того же вида.
В любом случае – врачам клиники, лечащим сибирскую язву любых форм, экспериментаторам, занимающимся определением чувствительности возбудителя к лекарственному препарату, либо производственнику антибиотиков необходимо знать истинную активность (концентрацию) препарата, которым он располагает. Тем более, если данный препарат хранился в непермессивных условиях.
Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов, среди которых наиболее распространены: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или в питательной агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ряд ускоренных методов [6].
Определение чувствительности микробов к антибиотикам in vitro проводится в условиях, значительно отличающихся от тех, в которых препарат действует в организме.
Концентрация стрептомицина в сыворотке крови человека при внутримышечном введении терапевтических доз препарата составляет всего 5-10 мкг/мл [6]. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) стрептомицина для обычных чувствительных штаммов B.anthracis колеблется от 0,25-10 мкг/мл. [7].
Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибиотикам должны отвечать следующим требованиям [6]:
1) быть стандартными и обеспечивать оптимальные условия роста микроорганизмов;
2) не содержать ингибиторов бактериального роста и чрезмерного количества стимуляторов;
3) не содержать веществ, подавляющих действие антибиотиков. Существенное влияние на результаты исследования оказывает pH среды. Например, активность стрептомицина значительно повышается с увеличением pH среды от 7,0 до 8,0. Большое воздействие на результаты исследования чувствительности B.anthracis к стрептомицину оказывают величина посевной дозы, возраст культуры бацилл, условия культивирования и др. факторы. При использовании метода диффузии в агар на результаты исследований влияют толщина слоя питательной среды, ее влажность, скорость диффузии антибиотика, скорость роста исследуемого (тестового) микроорганизма и др.
При определении концентрации антибиотика в биологических жидкостях и тканях используют также микробиологические методы исследования: метод диффузии в агар и метод серийных разведении антибиотика в жидкой или плотной питательных средах.
Метод диффузии в агаре. Метод основан на сравнении степени угнетения (или в стимуляции в случае StrD) роста микробов определенными концентрациями антибиотика (стрептомицина) в испытуемом материале с угнетением (или стимуляции) его роста известными концентрациями стандартного антибиотика (стрептомицина). Подавление (или стимуляция) роста тест-микроба осуществляется за счет диффузии антибиотика из исследуемого материала в плотную питательную среду. Рабочими стандартами служат специально изготовленные очищенные образцы антибиотиков [8], активность которых устанавливают по международным стандартным препаратам. Они сохраняются в запаянных ампулах при соответствующей (пермессивной) температуре. На этикетках указано содержание единиц или микрограммов активного вещества в 1 мг препарата.
Антибактериальная (или бактериостимулирующая у StrD тест-микроба) активность антибиотика (стрептомицина) выражается в единицах действия (ЕД), соответствующих действию определенной весовой части химически чистого препарата на тест-микроб. Для большинства антибиотиков (стрептомицин, канамицин, доксициклин и др.) 1 БД соответствует 1 мкг химически чистого препарата, а 1 мг такого препарата содержит 1000 ЕД.
Методом диффузии в агар можно определить концентрации любых антибиотиков (при наличии соответствующих тест-микробов), содержащихся в жидкостях (в крови, спинномозговой жидкости, моче, желчи, асцитической жидкости и тд.) и тканях организма (в легких, печени, почках, мозге, мышцах и т.д.).
Для определения концентрации антибиотика (стрептомицина) в сыворотке, кровь после образования сгустка центрифугируют, сыворотку отсасывают. Приготовленную сыворотку вносит в специальные лунки, изготовленные в агаровых пластинках, или цилиндрике без разведения (если предполагаемая концентрация антибиотика в крови не превышает контрольную), либо разводят нормальной сывороткой человека или буфером раствора (в случае определении активности стрептомицина используют фосфатный буфер с pH 7,5-8,0).
Для определения концентрации антибиотика (стрептомицина) в тканях органы, после удаления остатков крови взвешивают и гомогенизируют путем растирания с кварцевым песком или в специальном смесителе (дезинтеграторе). К гомогенату добавляют дистиллированную воду или соответствующий буфер. Полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 2500-3000 об/мин. Концентрацию определяют в надосадочной жидкости.
Для получения воспроизводимых результатов необходима строгая стандартизация опытов. Скорость диффузии экстрактов в агар зависит от буфера, в котором готовят растворы стандартного антибиотика (стрептомицина) и испытуемого материала, температуры и времени инкубации. Поэтому при определении концентрации антибиотиков (стрептомицина) в испытуемых субстратах подбирают условия для культивирования тест-культуры в определенной питательной среде, оптимальную pH среды, буферные растворы, обеспечивающих максимальную диффузию раствора антибиотика в среду и четкость очертания зон. Схема определения активности стрептомицина состоит из нескольких этапов.
Подготовка чашек со средами и тест-микробом. Для определения концентрации антибиотика (стрептомицина) в биологических субстратах или активности стрептомицина во флаконе с нарушением сроков и др. параметров хранения препарата можно проводить на двухслойном («градиентные пластинки») или однослойной питательной среде, содержащей различные концентрации антибиотика.
Метод «градиентных пластинок» описан Szybalski [9] и Брауном [10].
Среду с градиентом стрептомицина готовят следующим образом: питательный агар на основе казеина (КГА) [11] выливают в наклоненную чашку Петри; как только агар застынет, чашку устанавливают горизонтально и поверх первого слоя наносят слой агара с антибиотиком (рис.1). В результате диффузии антибиотика в нижний слой агара его концентрация становится пропорциональной толщине слоя агара и, таким образом, устанавливается линейный градиент концентрации.
Целью настоящего изобретения является определение активности (концентрации) стрептомицина в питательной среде в биологических тканях и жидкостях с помощью тест-культуры Bacillus anthracis Davies “R” БАЛ 31 StrD, депонированные нами в коллекционном центре ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» и ему присвоен номер В.anthracis KM104.
Для контроля точности и стандартности проведения исследований в каждом опыте необходимо использовать тест-культуры с известной чувствительностью (или зависимостью) к антибиотикам. ВОЗ рекомендует для этой цели три культуры Американской коллекции типовых культур: Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
Тест-культуры, применяемые в России при определении концентрации антибиотиков методом диффузии в агар, приведены в табл.20 [6].
Наиболее близким аналогом (прототипом) нашей тест-культуре B.anthracis Davies “R” БАЛ 31 StrD для определения концентрации стрептомицина в различных средах является Bacillus cereus var.mycoides 537 (шероховатая форма); 20000000 спор на 1 мл среды [6].
Однако вид В.cereus хотя и считается сапрофитом, но недавно опубликованы материалы [12] о том, что В.cereus может вызвать смертельные случаи у людей.
Штамм B.anthracis Davies “S” выделен из костей трупа [13] в 1955 году, автором предполагалось использовать его в качестве вакцинного штамма, но в последствии выяснилось, что хотя штамм Davies S авирулентен, но протективным эффектом он не обладает, поскольку у него отсутствует плазмида токсинообразования pXO1, а содержит он только плазмиду pXO2, детерминирующую капсулообразование.
Нами элиминирована у B.anthracis Davies “S” плазмида pXO2 (капсулообразования) и способом [7] придано свойство стрептомицинзависимости, т.е. получен бесплазмидный (полностью авирулентный) стрептомицинзависимый (StrD) в диссоциативный R форме штамм, пригодный для использования в качестве тест-культур при определении активности стрептомицина.
Предварительно из штамма B.anthracis KM104 необходимо получить варианты a, b, c с различными уровнями стрептомицинзависимости (StrD).
Для этого штамм B.anthracis KM104 (в споровой форме) высеивают продольным штрихом на градиентную чашку со Str 25 мкг/мл от min к max (рис.2).
Через трое суток на конусной части выросшего штриха обозначают участки a, b, c от более широкого (а), среднего по ширине участка (b) и острого участка штриха (с) (см. рис.2).
Для определения уровня стрептомицинзависимости вариантов тест-культуры a, b и c бактериальную массу в споровой форме (т.е. 3-5 суточного роста) из участков a, b и c суспендируют в дистиллированной воде до концентрации 107 спор/мл и высевают бактериологической петлей на питательные среды со стандартными концентрациями стрептомицина 10,5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/мл. Рост регистрируют через 24-48 часов инкубации при 35°С.
Пример 1.
Для определения уровня инактивации стрептомицина в питательной среде (КГА), хранящейся в течение 10 суток при комнатной ( 25°С) температуре, предварительно готовят: градиентные пластинки (чашки) (рис.3) со стрептомицин сульфата 50, 25, 10 мкг/мл, а также чашки с КГА однослойные, содержащие различные концентрации: 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/мл стандартного стрептомицина, – оставляют подготовленные питательные среды на 10 суток при комнатной температуре. Затем через 10 суток готовят еще партии питательных сред с такими же концентрациями стрептомицина. На каждую из питательных сред (свежеприготовленную и выдержанную в течение 10 суток) сеют штрихами 10-20·106 спор тест-культуры B.anthracis KM 104 (вариантов a, b и с). Результат роста (через 24-48 ч культивирования при 35°С) сравнивают (см. табл. 1). Анализ результатов, приведенных в табл. 1, позволяют утверждать, что 50% активности стрептомицина в питательной среде, хранившейся при комнатной температуре в течение 10 суток, инактивировалось.
Пример 2.
Для определения уровня инактивации стрептомицина в препаратах «стрептомицин сульфат» различного срока хранения использовали:
1) «стрептомицин сульфат» – серии 8151083 годен до XI-86 г.
2) «стрептомицин сульфат» – серии 1280791 годен до VIII-94 г.
3) «стрептомицин сульфат» – серии 3032000 годен до IV-2003 г.
4) «стрептомицин сульфат» – серии 150905 годен до Х-2008 г.
Предварительно готовят: градиентные пластинки (чашки) со Str 50, 25, 10 мкг/мл, а также чашки с КГА однослойные, содержащие различные концентрации: 10, 5, 2,5, 1,25 и 0,625 мкг/мл каждой серии препарата «стрептомицин сульфат».
На каждую из питательных сред, содержащих различные расчетные концентрации стрептомицина, четырех серий препарата сеют штрихами 20000000 спор тест-культуры B.anthracis Davies “R” StrD 31 БАЛ (вариатов a, b и с). Результаты роста (через 24-48 ч) культивирования при 35°С сравнивают (см. табл. 2) и делают соответствующие выводы.
Литература
2. – С.48-52.
2. Jnglesby Т., O. Toole Т., Henderson D., et al. Anthrax as a biological weapon, JAMA, 2002, – 287, – P.2236-2252.
3. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности: Санитарные правила. – М: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России. – 152 с. (С.42-43).
5. Соловьев В.Н. Стратегия современной химиотерапии бактериальных инфекций. – М: – «Медицина», 1973 – С.218-219.
7. Способ получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителей сибирской язвы из симбиотической смеси клеток Bacillus anthracis и скользящих бактерий – Myxococcus xanthus. Буланцев А.Л. (Ru), Липницкий А.В. (Ru). Патент 2233883., Бюл. 22, – 2004.
8. Государственная фармакопея СССР. М: «Медицина», изд. XI – 1987 – Т.1 – С.296-302.
64. – P.489.
10. Браун В. Генетика бактерий. – М: «Наука», 1968, – С.134-145.
11. Питательная среда для выращивания сибиреязвенных микробов. Александров Н.И., Николаенко Ю.П., Фатхинурова Т.И., Лазарева Е.С. Автор. свид. 400620, 1973, Бюл. 40.
12. Avashia S.B., W.S.Riggins et al. Fatal pneumonia among metalworkers due to inhalation exposure to Bacillus cereus containing B.anthracis taxin genes. Clin. Infect.Dis., 2007 – 44 (3) – P.414-416.
2 – P.86-87.
Формула изобретения
Способ определения остаточной активности стрептомицина с помощью споровой тест-культуры штамма Bacillus anthracis KM 104 (Bacillus anthracis Davies “R” БАЛ 31 StrD) в питательных средах, включающий посев спор ( 20000000 на мл. среды) на среды, содержащие различные расчетные концентрации антибиотика или его препарата, культивирование и последующее определение остаточной активности антибиотика, характеризующийся тем, что предварительно получают на градиентной пластинке Str 25 мкг/мл споры авирулентного бесплазмидного штамма Bacillus anthracis KM 104 в трех вариантах (а), (в), (с) с различным уровнем стрептомицинзависимости, для получения этих вариантов споры штамма В.anthracis KM 104 высевают одним длинным штрихом на градиентную чашку со Str 25 мкг/мл от минимальной (min) к максимальной (max) концентрации антибиотика, через 72 ч в конусной части выросшего штриха обозначают участки а, в и с от более широкого (а), среднего (в) и острого узкого участка (с), определяют уровни стрептомицин-зависимости вариантов а, в и с путем высева бактериальной массы соответствующего варианта бактериологической петлей на питательные среды со стандартными концентрациями стрептомицина 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/мл, рост вариантов а, в, с тестовой культуры учитывает через 24-48 ч культивирования в термостате при 35°С, об остаточной активности стрептомицина судят по отсутствию роста тест-культуры штамма на среде, содержащей стрептомицин в любой из приведенных концентраций.
РИСУНКИ
|