Патент на изобретение №2383891

(54) СПОСОБ КАЧЕСТВЕННОЙ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и касается способа предварительной экспресс-диагностики онкологических заболеваний. Способ заключается в отборе крови пациента, смешивании с реагентом и учете результатов реакции. В качестве реагента используют надосадочную жидкость, полученную при культивировании перевиваемой линии клеток почки эмбрионов свиньи в анаэробных условиях. О наличии онкологического заболевания судят при положительной реакции эритроцитов и отрицательной или положительной реакции цитратной крови с реагентом, а также при отрицательной реакции эритроцитов и положительной реакции цитратной крови с реагентом. Использование способа позволяет в короткие сроки сделать предварительное заключение о наличии онкологического заболевания.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для качественной клинической экспресс-диагностики крови при вынесении предварительного заключения об отсутствии или наличии онкологического заболевания.

Диагностика и выявление онкологических заболеваний на ранних стадиях является важной проблемой в медицине. Для диагностики рака используют такие методы, как рентгенологический, эндоскопический, ультразвуковой, морфологический, а также измерение концентрации ДНК в плазме или сыворотке крови онкологических больных. Однако эти методы не позволяют эффективно выявлять онкотрансформацию и не эффективны на ранних стадиях заболевания.

Известен способ ранней диагностики рака при помощи определения в крови концентрации внутриклеточных нуклеиновых кислот, связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови (см. патент РФ 2251696 по кл. МПК G01N 33/53, опубл. 10.05.2005). При нулевом значении этого показателя диагностируют рак.

Основным недостатком данного способа является его сложность.

Известен также способ диагностики онкологических заболеваний путем регистрации в крови величины биохимических показателей: витаминов А, Е и железозависимых, органосодержащих, антителоподобных белков, обладающих ложной СОД-активностью (см. патент РФ 2021612 по кл. МПК G01N 33/53, опубл. 15.10.1994).

Однако способ продолжителен во времени, требует значительных затрат и специального оборудования.

Наиболее близким к заявляемому является способ качественной предварительной экспресс-диагностики онкологического заболевания (см. патент РФ 2309405 по кл. МПК G01N 33/50, опубл. 27.10.2007), заключающийся в заборе крови, добавлении к ней реагента: смеси полярного органического растворителя и неполярного водорастворимого спирта, фильтрации смеси, отделении отстоявшегося верхнего окрашенного водноспиртового слоя и учете результатов реакции путем визуального сравнения цвета водно-спиртового слоя с цветным эталоном, цвета которого соответствуют цветам окраски аналогичного фильтрата заведомо здорового человека и людей на определенной стадии онкологического заболевания.

Однако способ не учитывает иммунную перестройку организма, поскольку основан на неспецифической реакции. Кроме того, способ требует значительного количества исследуемого материала – 25 мл крови, что может сказаться на самочувствии больных.

Изобретение направлено на решение задачи создания простого, эффективного и качественного способа предварительной экспресс-диагностики онкологических заболеваний, учитывающего иммунную реакцию организма на онкологические клетки и продукты их жизнедеятельности при минимальных затратах на его осуществление.

Для решения поставленной задачи в способе качественной предварительной экспресс-диагностики онкологических заболеваний, заключающемся в отборе крови пациента, смешивании с реагентом и учете результатов реакции, согласно изобретению дополнительно готовят 0,12-0,5% взвеси цитратной крови и отмытых эритроцитов одного и того же пациента, в качестве реагента используют надосадочную жидкость, полученную при культивировании перевиваемой линии клеток почки эмбрионов свиньи в анаэробных условиях, смешивают с реагентом отдельно взвесь цитратной крови и взвесь отмытых эритроцитов и выдерживают смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, затем определяют отдельно характеры реакций цитратной крови и отмытых эритроцитов с данным реагентом, при этом о наличии онкологического заболевания судят при положительной реакции эритроцитов и отрицательной или положительной реакции цитратной крови, а также при отрицательной реакции эритроцитов и положительной реакции цитратной крови.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано качественного способа предварительной экспресс-диагностики онкологических заболеваний, позволяющего эффективно, просто и быстро выявлять наличие онкологического заболевания с помощью реагента, в качестве которого используют надосадочную жидкость, полученную при культивировании перевиваемой линии клеток почки эмбрионов свиньи (СПЭВ) в анаэробных условиях.

Способ основан на одновременном учете характера реакций цитратной крови и отмытых эритроцитов одного и того же пациента с данным реагентом в виде надосадочной жидкости, полученной при культивировании клеток СПЭВ, и на явлении регуляции иммунного ответа.

Проведенными ранее исследованиями доказано наличие в культуре клеток СПЭВ, выращенной в анаэробных условиях, онкорнавирусов С и D в латентной форме (см. статью «Культивирование и накопление онкогенных вирусов в анаэробных условиях» авторов Ласкавого В.П., Дьяконова Л.П., Мельникова Г.В. «Ветеринарный врач». – 2. – 2004. – С.32-38). При этом культивирование осуществляли на питательной среде Игла 199 в течение 3-5 суток при соотношении питательной среды и воздушной фазы 1:5.

Авторами впервые выявлено использование надосадочной жидкости, полученной при культивировании клеток СПЭВ, содержащей вирусы С и D в латентной форме, для диагностики онкологических заболеваний. Обычно культуру клеток СПЭВ используют при культивировании вирусов в качестве субстрата для выделения и накопления различных возбудителей вирусных инфекций.

Явление регуляции иммунного ответа, зарегистрированное в качестве открытия 385 от 28.06.85 г., заключается в том, что в системе саморегуляции иммунитета организма участвуют, кроме Т- и В-лимфоцитов, и красные клетки крови. Иммунокомпетентные клетки, развиваясь как часть кроветворной системы, способны взаимодействовать с другими звеньями кроветворения (в частности, эритроидными) и испытывать регуляторные воздействия со стороны последних.

Механизм реакции цитратной крови и отмытых эритроцитов основан на естественном взаимодействии эритроцитов, содержащих на своей поверхности иммуноглобулины или комплексы иммуноглобулинов, с реагентом – надосадочной жидкостью, полученной при культивировании культуры клеток СПЭВ в анаэробных условиях (в течение 3-5 суток при соотношении питательной среды и воздушной фазы 1:5), содержащей онкорновирусы С и D в латентной форме.

Таким образом, иммуноглобулины, которые адсорбируются на поверхности эритроцитов, могут взаимодействовать с продуктами жизнедеятельности опухолевых клеток. Именно данное взаимодействие улавливаются реакциями цитратной крови и эритроцитов с реагентом.

При избыточном содержании продуктов жизнедеятельности онкологических клеток реакция с цитратной кровью может отсутствовать. Однако эта же реакция с отмытыми эритроцитами, которые освобождены от продуктов жизнедеятельности онкологических клеток, может стать положительной, при которой эритроциты вступают в реакцию с реагентом.

Известен способ диагностики инфекционных заболеваний животных, основанный на одновременном учете характера реакции цитратной крови и характера агглютинации эритроцитов одного и того же животного с одним и тем же антигеном (см. Патент РФ 2111492 по кл. МПК G01N 33/53, опубл. 20.05.98 г.). Однако он предназначен для диагностики инфекционных заболеваний животных, в частности вирусных – чумы и трансмиссивного гастроэнтерита свиней. В качестве реагента используют вирусные антигены в виде надосадочной жидкости, полученной при культивировании на культуре клеток СПЭВ соответствующего вируса.

Использование в качестве реагента для диагностики онкологических заболеваний надосадочной жидкости, полученной при культивировании только культуры клеток СПЭВ в анаэробных условиях (без культивирования на ней вируса), неизвестно.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 1-2 мл крови от одного пациента из локтевой вены.

Из части объема полученной цитратной крови готовят 0,12%-0,5% взвесь на физиологическом растворе. Для этого к 0,1 мл крови каждого пациента добавляют от 83 мл (для приготовления 0,12% взвеси) до 20 мл физраствора (для приготовления 0,5% взвеси).

К оставшемуся объему цитратной крови добавляют физраствор в объеме 1:10 и осуществляют отмывание эритроцитов путем трехкратного центрифугирования каждой пробы в течение 10 минут со скоростью 3000 об/мин. Затем из полученного осадка готовят также 0,12%-0,5% взвесь эритроцитов путем добавления к 0,1 мл осадка каждой пробы соответственно от 83 мл до 20 мл физраствора.

Берут заранее приготовленный реагент – надосадочную жидкость, полученную в результате культивирования культуры клеток СПЭВ в анаэробных условиях. Для этого культуру клеток СПЭВ засевают на питательную среду Игла 199, осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-5 суток при соотношении питательной среды к воздушной фазе 1:5. После разрушения клеток содержимое замораживают и оттаивают, затем центрифугируют в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.

Постановку реакций осуществляют на специальных планшетах с лунками, причем используют одновременно два набора лунок – для осуществления одновременного учета реакции с цитратной кровью и с отмытыми эритроцитами.

Один из рядов лунок в обоих наборах заполняют физраствором в количестве 0,2 мл в каждой.

Все лунки заполняют 0,12%-0,5% взвесями цитратной крови (в первом наборе) и эритроцитов (во втором наборе), которые берут в количестве 0,5 мл в каждой лунке.

При этом лунки с физраствором и данными взвесями будут являться контролем.

Берут реагент в количестве 0,1-0,3 мл и добавляют его во все лунки, кроме контрольных.

Оба набора смеси выдерживают при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, после чего производят учет реакции.

За положительный результат реакции принимают наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки.

За отрицательный результат реакции принимают наличие осадка в виде пуговки или точки на дне лунки.

При этом реакция в контроле должна быть всегда отрицательна.

Концентрация взвесей цитратной крови и эритроцитов (0,12-0,5%), количество вводимого реагента (0,1-0,3 мл), а также температурный режим (4-8°С), при котором выдерживают смесь в течение 12-15 часов, были подобраны экспериментальным путем.

Так, при концентрации ниже 0,12% и количестве реагента менее 0,1 мл реакции как с цитратной кровью, так и с эритроцитами практически отсутствуют, а при концентрации выше 0,5% и количестве реагента более 0,3 мл реакции не выражены, трудно учитываются.

Температурный режим, при котором происходит взаимодействие реагента с цитратной кровью и отмытыми эритроцитами, подбирался также экспериментально. Было опробировано 3 режима: при комнатной температуре (22°С), при 37°С и 4-8°С. При комнатной температуре и при 37°С реакции плохо выражены, трудно учитываются.

Положительная реакция эритроцитов и отрицательная реакция цитратной крови свидетельствуют об избытке продуктов жизнедеятельности онкологических клеток и значительной активизации иммунного ответа.

Положительная реакция эритроцитов и положительная реакция цитратной крови свидетельствуют о незначительном количестве продуктов жизнедеятельности онкологических клеток и активизации иммунитета.

Отрицательная реакция эритроцитов и положительная реакция цитратной крови свидетельствуют о значительной, но неэффективной активизации иммунного ответа на продукты жизнедеятельности онкологических клеток.

Пример 1.

Пациент А., мужчина, 56 лет.

В пробирку с гепарином отбирают 2 мл крови из локтевой вены.

Из части объема полученной цитратной крови готовят 0,25% взвесь на физиологическом растворе. Для этого к 0,1 мл крови каждого пациента добавляют 40 мл физраствора.

К оставшемуся объему цитратной крови добавляют физраствор в объеме 1:10 и осуществляют отмывание эритроцитов путем трехкратного центрифугирования каждой пробы в течение 10 минут со скоростью 3000 об/мин. Затем из полученного осадка готовят также 0,25% взвесь эритроцитов путем добавления к 0,1 мл осадка каждой пробы 40 мл физраствора.

Берут заранее приготовленный реагент – надосадочную жидкость, полученную в результате культивирования культуры клеток СПЭВ в анаэробных условиях.

Берут два набора лунок – для осуществления одновременного учета реакции цитратной крови и с отмытыми эритроцитами.

Один из рядов лунок в обоих наборах заполняют физраствором в количестве 0,2 мл в каждой.

Все лунки заполняют 0,25% взвесями цитратной крови (в первом наборе) и эритроцитов (во втором наборе), которые берут в количестве 0,5 мл в каждой лунке.

При этом лунки с физраствором и данными взвесями будут являться контролем.

Берут реагент в количестве 0,2 мл и добавляют его во все лунки, кроме контрольных.

Оба набора смеси выдерживают при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, после чего производят учет реакции.

Результат реакции цитратной крови с реагентом был отрицателен, а отмытых эритроцитов – положителен.

В дальнейшем пациент А проходил обследование ультразвуковым и цитологическим методами, был установлен точный диагноз – меланома кожи передней брюшной стенки.

Пример 2.

Пациент В., женщина, 58 лет.

Проводили исследования крови в соответствии с примером 1.

Результат реакции цитратной крови с реагентом был положителен, а эритроцитов – отрицателен.

В дальнейшем диагноз был уточнен – рак левой молочной железы.

Пример 3.

Пациент С., мужчина, 74 года.

Проводили исследования крови в соответствии с примером 1.

Результат реакции цитратной крови и эритроцитов с реагентом был положительным.

В дальнейшем диагноз был уточнен – рак толстого отдела кишечника.

Всего было обследовано 42 пациента, у 40 из которых (95%) было выявлено онкологическое заболевание, что подтверждалось общепринятыми методами диагностики. У одного из обследованных с помощью данного метода пациента с выявленной положительной реакцией через год была установлена онкология.

У контрольных пациентов (12 человек) ни в одном случае диагноз не был подтвержден.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявить предварительно, быстро и качественно наличие онкологических заболеваний. Способ удобен при массовых профилактических обследованиях населения, поможет заблаговременно, на ранних стадиях болезни, обратиться к врачу и принять необходимые эффективные меры по лечению болезни.

Формула изобретения

Способ предварительной экспресс-диагностики онкологических заболеваний, включающий отбор крови пациента, смешивание с реагентом и учет результатов реакции, отличающийся тем, что дополнительно готовят 0,12-0,5% взвеси цитратной крови и отмытых эритроцитов одного и того же пациента, в качестве реагента используют надосадочную жидкость, полученную при культивировании на перевиваемой линии клеток почки эмбрионов свиньи в анаэробных условиях, смешивают с реагентом отдельно взвесь цитратной крови и взвесь отмытых эритроцитов и выдерживают смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 ч, затем определяют отдельно характеры реакций цитратной крови и отмытых эритроцитов с данным реагентом, при этом о наличии онкологического заболевания судят при положительной реакции эритроцитов и отрицательной или положительной реакции цитратной крови с реагентом, а также при отрицательной реакции эритроцитов и положительной реакции цитратной крови с реагентом.