Патент на изобретение №2383618

(54) ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНАЗ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Иммобилизованный биокатализатор содержит клетки мицелиального гриба, продуцирующие пектиназы и включенные в матрицу содержащего поливиниловый спирт гелевого носителя. Гелевый носитель представляет собой криогель поливинилового спирта с макропорами сечением 0,5-5,0 мкм. Иммобилизованный биокатализатор получен на основе следующих компонентов, взятых в соотношении, мас.%: клетки мицелиального гриба (по сухой массе) 0,001-0,1; поливиниловый спирт 8,4÷12,5; водная фаза – до 100. Изобретение обеспечивает длительное сохранение иммобилизованным биокатализатором высокой механической прочности, жизнеспособности клеток мицелиальных грибов, обладающих пектолитической активностью. Время использования биокатализатора составляет 572-744 ч, средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,05-1,45 Ед.мл^-1ч^-1, а максимальная пектолитическая активность составляет 104160-830000 Ед.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе ферментов или клеток, помещенных в гелевый носитель, а также к процессам получения продуктов микробиологического синтеза с использованием иммобилизованных биокатализаторов, в данном случае – к получению пектиназ-ферментов, катализирующих гидролиз пектиновых веществ.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в пищевой промышленности, поскольку подобные ферменты широко применяются при переработке овощей и фруктов, а также в процессах производства соков, вина, кофе, чая. Обработка пектиназами различного сырья, содержащего пектин, позволяет существенно увеличить сокоотделение, снизить вязкость жидких сред, обеспечить высокую эффективность последующих технологических стадий переработки сельскохозяйственного сырья, в частности фильтрации, стерилизации, расфасовки и др.

В качестве основных критериев сравнительной оценки эффективности функционирования различных биокатализаторов, предназначенных для получения пектиназ, обычно применяют следующие показатели:

– суммарная пектолитическая активность (Ед.), которая может быть получена за все время использования биокатализатора, и

– продуктивность процесса, проводимого с использованием биокатализатора для получения пектиназ (Ед.мл^-1 ч^-1).

За единицу пектолитической активности принимают такое количество пектиназ, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 гидролизует полигалактуроновую кислоту с образованием 1 мкмоля редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы [Avigal G. Colorimetric assays for hexuronic acids and some keto sugars. In book: Methods in Enzymology. Carbohydrate metabolism (Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O.), V.XLI (Part B). N.Y. Acad. Press, 1975, p.29-30].

Одним из перспективных приемов повышения эффективности процессов получения пектиназ является использование гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроскопических грибов, позволяющих создавать высокие концентрации клеток в объеме реактора и, таким образом, увеличивать продуктивность процесса, а также скорость накопления внеклеточных пектиназ в среде культивирования.

Известен способ получения пектиназ путем твердофазного культивирования иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроскопических грибов Aspergillus niger [M.E.Acuna-Arguelles, M.Gutierrez-Rojas, G.Viniegra-Gonzalez, E.Faveva-Torres (1995) Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol, V.43, p.808-814], Aspergillus foetidus [S.F.Cavalitto, J.A.Arcas, R.A.Hours (1996) Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotech. Lett., V.18, p.251-256], а также Aspergillus orizae, Aspergillus awamory, Trichoderma sp. и др. [Dartora A.B., Bertolin Т.Е., Ilibio D., Silveira M.M., Costa J.A.V. (2002) Evaluation of filamentous fungi and inducers for the production of endopolygalacturonase by solid state fermentation Z. Naturforch., V.57, р.666-670]. В качестве носителей иммобилизованных клеток в этом случае используют различные твердые субстраты, индуцирующие синтез пектиназ. Основой таких субстратов обычно служат частицы измельченных пектинсодержащих отходов переработки сельскохозяйственной продукции (свекловичный жом, апельсиновые и лимонные корки, пшеничные отруби, яблочный жом и др.). Далее субстрат увлажняют до содержания влаги 55-80% средой, содержащей источники азотного питания и микроэлементов, необходимые для микроорганизмов, а также посевной материал (суспензию спор) в концентрации 10⁷-10⁸ спор/г основного сухого вещества. При этом происходит адсорбционная иммобилизация спор на поверхности частиц носителя. Далее проводят культивирование клеток, иммобилизованных на твердом носителе, в условиях, наиболее благоприятных для метаболической активности соответствующих штаммов микроорганизмов. Средняя продуктивность процесса по пектолитической активности с такими иммобилизованными биокатализаторами составляет 0,14 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная суммарная пектолитическая активность, накапливающаяся в среде за время использования иммобилизованных биокатализаторов (96 ч), достигает 40000 Ед.

Несмотря на простоту получения пектиназ с помощью таких иммобилизованных биокатализаторов, применение последних сопряжено с рядом значительных технологических сложностей и ограничений, так как этот вариант обладает следующими недостатками:

– для культивирования на твердой среде требуется наличие больших площадей для размещения емкостей с исходным основным твердым субстратом и осуществления твердофазного культивирования клеток с обеспечением их требуемой аэрацией;

– процесс характеризуется относительно большими временными и энергетическими затратами;

– при твердофазном культивировании клеток нельзя добиться однородного их роста по объему всего реактора с твердофазной средой, что усугубляется отсутствием перемешивания системы и отрицательно сказывается на показателях продуктивности биомассы;

– при использовании такого биокатализатора для получения пектиназ предполагается обводнение использованной твердой среды для экстракции внеклеточных ферментов из коржа, пронизанного грибным мицелием и образующегося в процессе культивирования клеток, с последующим его, так называемым “отжимом”, в результате которого клетки, составляющие биокатализатор, теряют жизнеспособность и не могут быть использованы повторно;

– сам биокатализатор и остатки твердой питательной среды представляют собой массовый отход производства в каждом рабочем цикле биокатализатора.

Все это отрицательно сказывается на экономических показателях процесса производства пектиназ с использованием такого иммобилизованного биокатализатора, который не обеспечивает хорошей технологичности процесса в целом.

Иммобилизация клеток с применением более совершенных носителей позволяет осуществлять ферментацию в жидких питательных средах, многократно использовать одни и те же клетки, продуцирующие внеклеточные пектиназы, и увеличить, таким образом, длительность использования одного и того же биокатализатора, а также повысить суммарный выход получаемой пектолитической активности и сократить экономические расходы на регулярное наращивание биомассы клеток и ее последующую утилизацию.

Так, известен иммобилизованный биокатализатор на основе клеток гриба Aspergillus awamori, адсорбированных на нерастворимом носителе – пенополиуретане. Процесс проводят следующим образом: в жидкую среду для выращивания клеток, содержащую пектин (20 г/л), лактозу (20 г/л), (NH₄)₂SO₄ (0,7 г/л), KCl (0,05 г/л) и MgSO₄×H₂O (0,001 г/л), помещают пенополиуретановую подложку в форме диска диаметром 4,5-5,0 см и толщиной 1,0-1,5 см, затем вносят споры гриба в концентрации (1,7-1,9)×10^5-1 ч^-1

Данный иммобилизованный биокатализатор обладает рядом недостатков:

– основным условием применения такого биокатализатора для получения пектиназ является отсутствие в питательной среде каких-либо твердых частиц, содержащих пектиновые вещества (свекловичный жом, яблочный жом и др.), так как в этом случае при возникающем механическом воздействии на биомассу наблюдается разрушение самого иммобилизованного биокатализатора, в частности отслоение мицелия от пенополиуретановой подложки;

– для сохранения эффективного функционирования иммобилизованного биокатализатора при его использовании для получения пектиназ необходимо обязательное периодическое (через каждые 230 ч) обновление мицелия на подложке, для чего проводят частичное удаление биомассы мицелия с пенополиуретановой поверхности с последующим наращиванием в течение 48-96 ч новой активной биомассы на поверхности подложки.

Таким образом, при эксплуатации данного иммобилизованного биокатализатора необходима регулярная утилизация отработанной мицелиальной биомассы, а также экономические и временные затраты на ее регенерацию на носителе, что в целом существенно снижает технологичность процесса получения пектиназ.

Известны иммобилизованные биокатализаторы для получения пектиназ на основе клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу полимерного геля. В большинстве случаев в составе таких иммобилизованных биокатализаторов используют клетки мицелиальных грибов Aspergillus niger 26 или Aspergillus sp. В качестве носителя наиболее часто при этом применяют Са-альгинатный гель. Сам иммобилизованный биокатализатор представляет собой клетки мицелиального гриба, обладающие секреторной пектолитической активностью, включенные в сферические гранулы (диаметром 2-4 мм) ионо-тропного Са-альгинатного геля. Такой иммобилизованный биокатализатор получают на основе композиций, представляющих собой суспензию спор (от 2×10⁷ до 10⁹ спор/мл) в водном 0,1%-ном растворе Тритона Х-100 или 0,01% растворе Твин-80 в смеси с 2-3%-ным раствором альгината натрия, которую прокапывают в раствор 1,5-2,0%-ного хлорида кальция при комнатной температуре, выдерживают полученные гранулы в том же растворе 1-2 ч при 0-4°С, отделяют от раствора, промывают 3-4 раза дистиллированной водой и далее культивируют сформированный таким образом иммобилизованный биокатализатор в питательной среде для получения пектиназ. Максимальное значение средней продуктивности такого процесса по пектолитической активности составляет 0,57 Ед мл^-1 ч^-1 [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за время использования иммобилизованных биокатализаторов (648 ч), достигает 71700 Ед [Angelova М., Sheremetska P., Lekov М., Enhanced polymethylgalacturonase production from Aspergillus niger 26 by calcium alginate immobilisation. (1998) Proc. Biochem., V.33, p.299-305].

Несмотря на возможность длительной эксплуатации таких иммобилизованных биокатализаторов и довольно высокую получаемую при этом суммарную пектолитическую активность, основным недостатком данного технического решения, существенно ограничивающим его применение, являются недостаточные механическая прочность и операционная стабильность гранул иммобилизованного биокатализатора, которые сказываются на том, что:

– в ходе ферментации происходит изменение формы биокатализатора – его деформация под действием внешних факторов, в частности сжатия вследствие сдвиговых напряжений, возникающих при перемешивании среды, а также из-за давления кислорода извне гранул, подаваемого в реактор, и углекислого газа, выделяемого клетками внутри гранул (в результате ухудшаются процессы массопереноса в частицах носителя, что приводит к снижению продуктивности иммобилизованной культуры);

– имеет место постепенное разрушение матрицы Са-альгинатного геля в среде культивирования иммобилизованных клеток, содержащей фосфат-ионы, являющиеся, в свою очередь, обязательным компонентом питательных сред, используемых для синтеза пектиназ;

– происходит биохимическое разрушение матрицы носителя, представляющего собой природный полисахарид, под действием гидролитических ферментов, синтезируемых и выделяемых в среду самими иммобилизованными клетками мицелиальных грибов.

Для упрочнения гранул подобных иммобилизованных биокатализаторов предложена их дополнительная обработка сшивающим агентом, в частности глутаровым альдегидом. Так, гранулы, полученные включением спор мицелиальных грибов в Са-альгинатный гель аналогично тому, как это описано выше, переносят после экспонирования их в 1,5-2,0%-ном растворе хлорида кальция при 0-4°С в течение 1-2 ч в 0,3 М раствор глутарового альдегида и выдерживают в нем 0,5 ч, после чего 3-4 раза промывают дистиллированной водой. В результате происходит упрочнение гранул, но вследствие высокой токсичности глутарового альдегида по отношению к клеткам все основные характеристики (средняя продуктивность процесса с использованием биокатализатора и суммарно накапливающаяся в среде пектолитическая активность) снижаются в 4,8-8,0 раз [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergillus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], что является существенным недостатком такого технического решения.

Согласно другому техническому решению тех же авторов [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140] упрочнение гранул биокатализатора, полученного включением клеток мицелиальных грибов в Са-альгинатный гель, достигается в результате частичной замены Са-альгинатного геля на гель поливинилового спирта, сшитого ионами бората. Это известное техническое решение реализуется следующим образом: к 20 мл смеси 10% раствора поливинилового спирта и 0,5% раствора альгината натрия добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus niger с концентрацией 10⁷ спор/мл. Для формирования гранул иммобилизованного биокатализатора полученную смесь прокапывают в насыщенный раствор борной кислоты, содержащий 0,3 М CaCl₂·2H₂O, и аккуратно перемешивают в течение 1 ч. Далее полученные гранулы переносят в 0,3 М раствор NaH₂PO₄×2H₂O (рН 4,5) на 2 ч для придания им прочности, после чего их промывают водой и далее культивируют в питательной среде для получения пектиназ. Таким образом, в состав полученного иммобилизованного биокатализатора входят клетки мицелиального гриба, альгинат в комплексе с ионами кальция, поливиниловый спирт в комплексе с ионами бората и водная фаза. Точное содержание компонентов из опубликованной информации вычислить невозможно, т.к. неизвестно, в какой пропорции ионы кальция и бората связываются полимерными компонентами системы – альгинатом и поливиниловым спиртом, соответственно. Средняя продуктивность этого иммобилизованного биокатализатора по пектиназной активности составляет 0,012 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная ферментативная активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (72 ч), достигает 222 Ед.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу иммобилизованного биокатализатора, принципу иммобилизации клеток мицелиальных грибов (включение в матрицу гелевого носителя) и полимерной основе носителя (содержащий поливиниловый спирт гелевый носитель) принято за прототип.

Это известное техническое решение имеет следующие недостатки:

1. В состав иммобилизованного биокатализатора-прототипа входят полианион-альгинат и полиол-поливиниловый спирт, предрасположенные к образованию нерастворимых полимерных комплексов, в свою очередь способных блокировать («закупоривать») транспортные каналы в клеточной стенке, через которые клеткой осуществляется секреция продуктов биосинтеза (в данном случае, пектиназ), что может быть одной из причин низкой продуктивности прототипа. Таким образом, присутствие поливинилового спирта в составе известного иммобилизованного биокатализатора является неблагоприятным фактором.

2. Полимерная матрица носителя иммобилизованного биокатализатора-прототипа представляет собой смешанный гель альгината кальция и поливинилового спирта, сшитого ионами бората. Процесс сшивания проводится в среде борной кислоты с низким значением рН, что отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток и предопределяет низкий уровень суммарной пектиназной активности готового иммобилизованного биокатализатора.

3. Сам иммобилизованный биокатализатор не выдерживает эксплуатации более 72 ч вследствие того, что носитель теряет свою исходную прочность и разрушается в среде культивирования.

Задачей предлагаемого технического решения является разработка высокопродуктивного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток мицелиальных грибов, способных в иммобилизованном состоянии секретировать внеклеточные пектиназы в течение длительного времени культивирования.

Поставленная задача решается тем, что заявляемый иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ содержит способные продуцировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу содержащего поливиниловый спирт гелевого носителя, который представляет собой криогель поливинилового спирта с макропорами сечением 0,5-5,0 мкм, причем иммобилизованный биокатализатор получен на основе следующих компонентов, взятых в соотношении, мас.%: клетки мицелиального гриба (по сухой массе) 0,001÷0,1; поливиниловый спирт 8,4÷12,5; водная фаза – до 100.

Предлагаемое изобретение предусматривает формирование криогеля поливинилового спирта с одновременной иммобилизацией клеток мицелиальных грибов. После иммобилизации препарат помещается в среду культивирования, содержащую компоненты, необходимые для роста мицелия, т.е. образования полноценных жизнеспособных клеток, которые в таком иммобилизованном состоянии синтезируют и секретируют пектиназы. При этом заявляемый диапазон сечения макропор данного носителя найден экспериментально и обусловлен тем, что при сечении пор меньше 0,5 мкм наблюдается угнетение развития мицелия продуцента пектиназ в матрице криогеля поливинилового спирта, а при сечении пор более 5,0 мкм имеет место заметное прорастание гиф за пределы носителя, что при работе в реакторах с перемешиванием частиц иммобилизованного биокатализатора вызывает отрыв фрагментов мицелия, загрязняющих, тем самым, культуральную среду, содержащую целевой продукт.

Состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора также найден экспериментально, причем, как оказалось, поливиниловый спирт в этом случае, в отличие от прототипа, не оказывает негативного влияния на биосинтетический и секреторный потенциал иммобилизованных клеток. Нижний предел концентрации заявляемого содержания поливинилового спирта определяется тем, что при меньшей, чем 8,4 мас.% концентрации этого гелеобразующего полимера, заметно снижаются физико-механическе характеристики иммобилизованного биокатализатора, а при более чем 12,5 мас.% содержании поливинилового спирта сильно повышается ее вязкость исходной системы, используемой для приготовления иммобилизованного биокатализатора, что затрудняет равномерное диспергирование биомассы в такой среде. Нижний предел концентрации клеток в заявляемом составе иммобилизованного биокатализатора определяется тем, что при использовании меньшей, чем 0,001 мас.% концентрации получаемый иммобилизованный биокатализатор обладает заметно меньшей пектолитической активностью, а верхний предел концентрации клеток определяется тем, что при использовании концентрации больше 0,1 мас.% происходит неполное включение всех клеток, введенных в смесь с раствором полимера, в формирующийся криогель поливинилового спирта и затем наблюдается их вымывание при помещении полученных гранул в культуральную среду для получения пектиназ. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.

Получение биомассы клеток каждого конкретного мицелиального гриба для последующего включения в матрицу гелевого носителя проводится с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками конкретной культуры.

После получения клеток (для включения в криогель поливинилового спирта могут быть использованы как покоящиеся (споровый материал), так и вегетативные формы) их диспергируют в растворе поливинилового спирта с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что в результате приводит к образованию полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки мицелиального гриба, обладающего пектолитической активностью.

В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается либо в соответствующей форме, либо гранулируется с помощью специального устройства, например криогрануляционных установок [Патент РФ 2036095 (1992); Патент РФ 2104866 (1996)].

Получение пектиназ с помощью заявляемого иммобилизованного биокатализатора проводят путем культивирования иммобилизованных клеток в различного рода аэробных реакторах с жидкими питательными средами, традиционно применяемыми в процессах с клетками мицелиальных грибов, являющихся продуцентами внеклеточных пектиназ. Затем целевые ферменты, накопленные в культуральной среде, могут быть либо непосредственно использованы (например, в виде концентратов или высушенных препаратов) в соответствующих процессах обработки пектинсодержащих субстратов, либо, в случае необходимости (например, для получения образцов реагентной чистоты), выделены из культуральной жидкости известными приемами (например, с помощью высаливания, различных видов хроматографии, ультрафильтрации, изоэлектрофокусирования и др.).

Такой иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ и такое сочетание признаков, как обладающие способностью секретировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу именно макропористого (сечение пор 0,5-5,0 мкм) криогеля поливинилового спирта, а также такой качественный и количественный состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора, как клетки мицелиального гриба (0,001÷0,1 мас.%), способного секретировать внеклеточные пектиназы, гелеобразующий полимер – поливиниловый спирт (8,4÷12,5 мас.%) и водная фаза (до 100 мас.%), ранее известны не были и являются новым, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus niger F-679 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 100 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 10 мл суспензии клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Aspergillus niger с концентрацией 5×10⁶ кл./мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1,4-1,6 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Патенту РФ 2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -15°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 24 ч, оттаивание гранул проводят при 8°С. Получают 110 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 1,5-2,5 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,018; поливиниловый спирт 10; водная фаза – до 100.

Ферментационный процесс получения пектиназ проводят в условиях, аналогичных прототипу (500-мл колба Эрленмейера, содержащая 100 мл питательной среды (рН 5,0) следующего состава, г/л: свекловичный пектин (15,0), NH₄SO₄ (5,0), MgSO₄×7H₂O (0,2), FeSO₄×7H₂O (0,01); NaCl (5,0), KH₂PO₄ (0,1), температура культивирования 30°С). При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,41 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время ферментации (648 ч), достигает 191870 Ед.

Пример 2. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus foetidus F-531(ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 47,5 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 2,5 мл суспензии клеток (вегетативная форма) мицелиального гриба Aspergillus foetidus F-531 с концентрацией 5×10⁸ кл./мл, полученных после смыва спор с поверхности твердой питательной среды 0,9% раствором NaCl и их экспонирования в этом растворе в течение 1 ч при комнатной температуре с целью инициации процесса вегетации спор, перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования гранул. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в лунки 96-луночных иммунологических плашек со сферическим дном по 0,15 мл. Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -13°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 16 ч, оттаивание гранул проводят при 4°С. Получают 50 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего споры мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 3,5-5,0 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,1; поливиниловый спирт 11,4; водная фаза – до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 1-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: цитрусовый пектин (8,0), глюкоза (10,0), NH₄NO₃ (7,5), KH₂PO₄ (1,0), MgSO₄×7H₂O (0,5), FeSO₄×7H₂O (0,01), CaCl₂ (0,1); температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,43 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время его использования (744 ч), достигает 106500 Ед.

Пример 3. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 115 г 13%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 5 мл суспензии (3×10⁸ кл/мл) клеток (вегетативная форма) мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9, полученной после смыва спор с поверхности твердой питательной среды стерильной водопроводной водой и их экспонирования в течение 30 мин при комнатной температуре с целью инициации выхода клеток из состояния покоящейся формы, и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для получения гранул. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку). Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 16 ч, оттаивание гранул проводят при 6°С. Получают 120 г криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 0,5-1,2 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,087; поливиниловый спирт, 12,5; водная фаза – до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 2-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: яблочный пектин (15,0), NH₄NO₃ (7,5), KH₂PO₄ (1,0), MgSO₄×7H₂O (0,5), глюкоза (5,0); температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,14 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время его использования (720 ч), достигает 164160 Ед.

Пример 4. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Penicillium funiculosum F-149 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 1050 г 16%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 950 мл суспензии (5×10⁵ кл/мл) клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Penicillium funiculosum F-149, полученных после смыва спор с поверхности твердой питательной среды 0,9% раствором NaCl и их хранения в этом растворе в течение 16 ч при температуре 8°С, и перемешивают до получения однородной массы. Затем ее выливают ровным слоем толщиной 0,5 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -18°С, где препарат выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание проводят при 4°С. Получают криогель поливинилового спирта в виде листового материала, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 0,8-1,9 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,001; поливиниловый спирт 8,4; водная фаза – до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в биореакторе с проточным режимом культивирования при непрерывном перемешивании среды (5-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: пектат натрия (10,0), NH₄NO₃ (7,5), КН₂РО₄ (1), MgSO₄×7H₂O (0,05), глюкоза (5,0)), где иммобилизованный биокатализатор помещен в виде свернутого листа; температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,45 Ед мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (572 ч), достигает 830000 Ед.

Пример 5. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 500 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 100 мл суспензии (5×10⁷ кл/мл) клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования гранул с помощью криогрануляционной установки (Патент РФ 2036095) в следующих условиях: замораживание осуществляют при -13°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 28 ч, оттаивание гранул проводят при 4°С. Получают 600 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 3,2-4,6 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,04; поливиниловый спирт 10; водная фаза – до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 2,5-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду, состав которой указан в Примере 2; температура процесса 30±0,5°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,05 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (600 ч), достигает 315000 Ед.

Таким образом, заявляемое техническое решение приводит к получению иммобилизованного биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. Заявляемое техническое решение предусматривает применение синтетического полимера – поливинилового спирта – для формирования гелевого носителя, устойчивого к ферментативной атаке иммобилизуемыми клетками, что в результате способствует длительному (до 744 ч) сохранению иммобилизованным биокатализатором высокой механической прочности.

2. Включение клеток мицелиальных грибов, обладающих пектолитической активностью, в матрицу криогеля поливинилового спирта сохраняет их жизнеспособность и целевую ферментативную активность, что позволяет получать иммобилизованные биокатализаторы, обладающие высокой удельной и суммарной продуктивностями, и в то время как в случае прототипа наблюдалось заметное снижение этих показателей.

3. В заявляемом техническом решении, в отличие от аналогов, не используются для упрочнения носителя токсичные вещества, например глутаровый альдегид, что в случае предлагаемого изобретения способствует сохранению более высокого уровня жизнеспособности иммобилизуемой биомассы, а также повышает технологическую и экологическую безопасность производства биокатализатора.

4. Поскольку носитель иммобилизованных клеток-продуцентов пектиназ – криогель поливинилового спирта – обладает макропористостью (сечение крупных пор от 0,5 до 5,0 мкм), то это обеспечивает благоприятные условия для иммобилизованной биомассы в отношении поступления субстратов (включая кислород для дыхания аэробных мицелиальных грибов) к клеткам и отвода продуктов жизнедеятельности, включая секретируемые внеклеточные пектиназы, от клеток, что в совокупности обеспечивает существенно лучшие показатели продуктивности заявляемого иммобилизованного биокатализатора по сравнению с аналогами и прототипом.

5. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала-криогеля поливинилового спирта, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет варьировать форму гранул биокатализатора и использовать его в различных реакторах, в том числе и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно увеличивает скорость массообменных биокаталитических процессов. Как результат, заявляемое изобретение позволяет получить иммобилизованный биокатализатор, обладающий существенно улучшенными (по отношению к аналогам и прототипу) характеристиками, а именно, как минимум, в 1,5 раза (Пример 2), а в максимуме – в 11,5 раз (Пример 4) увеличенной суммарно накапливающейся пектолитической активностью при использовании биокатализатора и, как минимум, в 1,8 раза (Пример 5), а в сравнении с прототипом – в 120 раз, увеличенной средней продуктивностью процесса по пектолитической активности.

6. Заявляемое техническое решение обладает высокой универсальностью в отношении иммобилизуемых культур, поскольку положительный эффект при реализации данного изобретения может быть получен при использовании клеток самых разных мицелиальных грибов, являющихся продуцентами внеклеточных пектиназ (см. примеры 1-5).

Формула изобретения

Иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ, содержащий способные продуцировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу содержащего поливиниловый спирт гелевого носителя, отличающийся тем, что гелевый носитель представляет собой криогель поливинилового спирта с макропорами сечением 0,5-5,0 мкм, причем иммобилизованный биокатализатор получен на основе следующих компонентов, взятых в соотношении, мас.%: