Патент на изобретение №2383060

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТДАЛЕННОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине. Для диагностики отдаленной энцефалопатии у мелких лабораторных животных осуществляют воздействие парами металлической ртути. Дважды регистрируют результаты в динамике постконтактного периода: 1-й срок сразу после окончания воздействия парами металлической ртути, 2-й срок – спустя 9 недель. Фиксируют у животных показатели: количество и длительность актов “норка”, стойка с упором, грумминг, время удержания на вращающемся стержне, количество животных, атакующих чужака. При уменьшении во 2-й срок обследования количества актов “норка” свыше 22% по сравнению с контрольной группой, длительности актов “норка” свыше 45%, количества животных, выполняющих акт стойка с упором, свыше 40%; при возрастании длительности актов грумминг в 4,5 раза и более, увеличении количества животных, атакующих чужака, в 1,9 раза и более, времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более диагностируют отдаленную токсическую энцефалопатию. Способ позволяет оценить отдаленные эффекты экспериментальной токсической энцефалопатии, максимально приблизив их к диагностическим критериям, используемым у людей при верификации токсической энцефалопатии в отдаленном периоде. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной медицине, и касается способов диагностики токсической энцефалопатии.

Токсические энцефалопатии являются одними из наиболее частых причин первичной инвалидизации. У значительной части пациентов, перенесших острое воздействие нейротоксикантов, в последующем отдаленном периоде сохраняется неврологическая симптоматика, которая нередко имеет прогредиентный характер с развитием хронически текущего нейродегенеративного процесса, существенно снижая качество жизни [2, 4].

Рост частоты токсических энцефалопатии и относительно невысокая эффективность существующих методов реабилитации определяют необходимость изучения механизмов развития патологических процессов в ткани мозга как на ранних стадиях токсического повреждения, так и в течение относительно длительного периода, что в клинических условиях зачастую неосуществимо. Центральное место в изучении существа и динамики патологического процесса в центральной нервной системе (ЦНС) занимают экспериментальные модели на животных; большое значение при этом имеют информативность и доступность методов оценки токсических поражений нервной ткани.

В качестве критериев оценки функционального состояния ЦНС применяется комплексный подход, включающий в себя использование универсальных методов, направленных на обнаружение двигательных расстройств и нарушений ориентировочно-исследовательского поведения как проявление высшей нервной деятельности [6].

Известны способы оценки эффективности моделирования постгеморрагической, постгипоксической и токсической энцефалопатии по наличию нарушений условно-рефлекторной деятельности и поведенческой активности. Наиболее близким, прототипом, является способ моделирования гипоксической энцефалопатии [5]. Однако данные методы оценки функции ЦНС посвящены острой токсической энцефалопатии, и не описано их использование в качестве критериев диагностики токсической энцефалопатии в отдаленном периоде после прекращения воздействия. В то время как при анализе результатов экспериментального моделирования токсической энцефалопатии важно учитывать временной фактор, поскольку имеются весьма существенные различия в информативности тех или иных тестов в различные сроки с момента создания токсической энцефалопатии

Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способов диагностики отдаленной токсической энцефалопатии у мелких лабораторных животных. Способ также расширяет арсенал критериев и методов оценки патологического процесса в ЦНС при моделировании отдаленной токсической энцефалопатии.

Поставленная задача достигается тем, что:

диагностику отдаленной токсической энцефалопатии проводят после воздействия на животных парами металлической ртути и спустя 9 недель по результатам изменений двигательной и эмоциональной активности, неврологического статуса и ориентировочно-исследовательского поведения в сравнении с контрольной группой и при уменьшении количества актов «норка» свыше 22%, длительности актов «норка» свыше 45%, уменьшении количества животных, выполняющих акт стойка с упором, свыше 40%, возрастании длительности актов грумминг в 4,5 раза и более, количества животных, атакующих чужака, в 1,9 раза и более, увеличении времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более диагностируют отдаленную токсическую энцефалопатию.

Заявленный способ отличается от прототипа тем, что диагностику отдаленной токсической энцефалопатии проводят дважды в динамике постконтактного периода: 1-й срок сразу после окончания воздействия парами металлической ртути, 2-й срок – спустя 9 недель, оценивая вектор изменений двигательной и эмоциональной активности, неврологического статуса и ориентировочно-исследовательского поведения в сравнении с контрольной группой и при уменьшении во 2-й срок обследования количества актов «норка» свыше 22%, длительности актов «норка» свыше 45%, уменьшении количества животных, выполняющих акт стойка с упором, свыше 40%, возрастании длительности актов грумминг в 4,5 раза и более, а также количества животных, атакующих чужака, в 1,9 раза и более, увеличении времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более диагностируют отдаленную токсическую энцефалопатию.

При моделировании патологических процессов в нервной ткани, в том числе и токсических энцефалопатий, экспериментаторы отдают предпочтение грызунам, поскольку строение сосудов мозга, их топография, молекулярная и клеточная биология нервных клеток грызунов имеют высокую степень гомологии с высшими млекопитающими [6].

Экспериментальные исследования, посвященные оценке функционального состояния ЦНС при токсической энцефалопатии в отдаленном постконтактном периоде, сопоставимом у мелких лабораторных животных со временем развития отдаленной токсической энцефалопатии у человека (в среднем 8-9 лет), до настоящего времени не проводились. Авторами не найдено в проанализированной литературе способа диагностики отдаленной токсической энцефалопатии при воздействии нейротоксикантов.

Таким образом, заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «Промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине (токсикологии, фармакологии, патологической физиологии) для моделирования патологических состояний животных и человека.

Способ осуществляется следующим образом:

проводят затравку лабораторных животных (белых крыс) парами металлической ртути. Результаты оцениваются сразу после затравки (1-й срок обследования) и через 9 недель (2-й срок обследования) после окончания воздействия нейротоксикантом. Оценку состояния центральной нервной системы животных осуществляют по регистрации показателей ориентировочно-исследовательского поведения, эмоционального состояния, неврологического статуса, внутривидовой агрессии [1]. Ориентировочно-исследовательскую активность и эмоциональное состояние оценивают по методу «открытое поле»: фиксируют количество и длительность актов: норка, стойка с упором, грумминг. Идентификацию отдельных поведенческих паттернов (актов) проводят на основании вероятности появления того или иного акта и времени, затрачиваемого на выполнение отдельных поведенческих актов. Неврологический статус, включающий состояние мышечного тонуса и равновесия, оценивают по времени удержания на вращающемся стержне. Для оценки индивидуальной выраженности внутривидовой агрессии наблюдают контакт каждой опытной крысы с крысой-чужаком в тесте «Чужак-резидент». Зоосоциальное поведение (внутривидовую агрессию) характеризуют количеством атак на чужака у животных опытной группы. Все изучаемые показатели у животных опытной группы сравнивают с аналогичными показателями контрольной группы. И при уменьшении во 2-й срок обследования количества актов «норка» свыше 22%, длительности актов «норка» свыше 45%, уменьшении количества животных, выполняющих акт стойка с упором, свыше 40%, возрастании длительности актов грумминг в 4,5 раза и более, количества животных, атакующих чужака, в 1,9 раза и более, увеличении времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более диагностируют отдаленную токсическую энцефалопатию.

Предлагаемый способ был применен в эксперименте на беспородных крысах в количестве 150 особей массой 180-240 г. Белые крысы получены из собственного питомника АФ-НИИ МТ и ЭЧ ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Лабораторное животное (белые крысы) помещали на 4 часа в стандартную затравочную камеру, содержащую пары металлической ртути со средней концентрацией 0.36 мг/м³. Ингаляционную затравку проводили 5 раз в неделю в течение 7 недель. Результаты оценивали сразу после окончания ингаляционного воздействия нейротоксикантом и через 9 недель.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы Excel «описательная статистика» с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [3].

Результаты исследования

Установлено, что сразу после окончания ингаляционного воздействия парами металлической ртути животные опытной группы становились более гиперактивными по сравнению с контрольными. Анализ двигательной активности в открытом поле позволил выявить возрастание общего числа двигательных актов (соответственно 62,98±3,64 в опыте и 52,30±3,96 у контрольных животных, р<0,05), различие в исследовательском поведении у животных с ингаляционной экспозицией металлической ртути, заключавшееся в увеличении числа обследований отверстий открытого поля (табл.). На первом этапе обследований наблюдалось достоверно значимое повышение числа актов «обнюхивание», уменьшено число актов «вертикальная стойка», «грумминг» и количество животных с регистрируемыми актами «стойка с упором». Изменение числа указанных двигательных актов свидетельствовало также и о высоком уровне негативно-эмоционального состояния и наличии тревожности. Повышение двигательной активности белых крыс подтверждало и достоверно значимое снижение времени, занятого на выполнение акта «сидит» (соответственно 6,03±0,53 сек и 7,87±0,82 сек у контрольных животных, р<0,05). Повышение исследовательской и локомоторной активности представляет собой один из важнейших типов изменения поведения животных, свидетельствующий о нарушении компенсаторных механизмов адаптации к длительному ингаляционному воздействию нейротоксиканта.

При обследовании белых крыс через 9 недель после прекращения ингаляционного воздействия парами металлической ртути нарушение двигательной активности сохранялось, однако имело иную направленность. У животных с ртутной экспозицией резко уменьшился исследовательский компонент двигательной активности, оцениваемый по количеству «норок». Число обследований отверстий открытого поля среди белых крыс, у которых регистрировался данный поведенческий акт, было достоверно снижено по сравнению с контрольными животными, реже отмечался акт «стойки с упором» (табл.). При изучении длительности поведенческих паттернов установлено, что время, затрачиваемое в среднем одной белой крысой опытной группы на «грумминг», свидетельствующее о негативной эмоциональности, возросло в 4,5 раза (соответственно 2,33±0,94 сек и 0,52±0,23 сек у контрольных животных). Длительность акта «норка» была ниже у белых крыс опытной группы (3.92±0.87 сек), чем у контрольных животных (7.1±1.45 сек).

Изучение зоосоциального поведения животных выявило при обследовании в первый срок после окончания ингаляционного воздействия повышение количества белых крыс в опытной группе с взаимными вертикальными стойками, характерными для слабовыраженного типа агрессивного поведения. В отдаленный период токсической энцефалопатии агрессивность животных опытной группы резко возрастала, достоверно значимо отличаясь от контрольных животных по количеству особей с развернутыми атаками на «чужака» (табл.).

Ингаляционное воздействие парами металлической ртути приводило к выраженным неврологическим нарушениям, которые сохранялись длительный период (до 9 недель). В оба срока обследования время удержания на вращающемся со скоростью 8 оборотов в минуту стержне достоверно больше у белых крыс, получивших ингаляционную экспозицию парами ртути (табл.).

Оценивая полученные результаты в целом, можно заключить, что ингаляционное воздействие парами металлической ртути в течение 7 недель в концентрации 0,36 мг/м³ приводило к возникновению у белых крыс нарушений ориентировочно-исследовательского и зоосоциального поведения, неврологического статуса, выявляемых комплексом тестов, информативность и направленность которых имела весьма существенные отличия в различные временные сроки с момента создания токсической энцефалопатии.

При обследовании сразу после окончания ингаляционного воздействия парами металлической ртути установлено повышение общей двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения, мышечного гипертонуса, увеличение тревожности, негативной эмоциональности и слабовыраженная агрессивность. Развитие токсической энцефалопатии, формирующейся в отдаленный период после ингаляционного воздействия металлической ртути, сопровождалось снижением мотивации к ориентировочно-исследовательскому поведению, эмоционально-негативным состоянием, возрастанием зоосоциальной агрессивности и длительной сохранностью нарушений неврологического статуса в виде мышечного гипертонуса.

Таким образом, критериями диагностики отдаленной токсической энцефалопатии в эксперименте являются изменения по сравнению с контрольными животными:

– ориентировочно-исследовательского поведения, выражавшиеся в повышении в 1-й срок обследования с последующим его снижением: уменьшение количества актов «норка» на 22% и более, длительности актов «норка» на 45% и более, уменьшение количества животных, выполняющих акт стойка с упором, на 40% и более;

– эмоционально-негативного состояния: возрастание длительности актов грумминг в 4,5 раза и более;

– зоосоциального поведения, сопровождавшегося возрастанием агрессивности: увеличение количества животных, атакующих чужака, в 1,9 раза и более;

– неврологического статуса: увеличение времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более.

Предлагаемый способ диагностики, отражая существенные стороны патогенеза токсической энцефалопатии, позволяет оценить отдаленные эффекты экспериментальной токсической энцефалопатии, максимально приблизив их к диагностическим критериям, используемым у людей при верификации токсической энцефалопатии в отдаленном периоде.

Литература

1. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / пер, с англ. Под ред. проф. А.С.Батуева. – М.: Высшая школа, 1991.-398 с.

2. Клиника, диагностика, лечение и реабилитация в отдаленном периоде профессиональной нейроинтоксикации у пожарных. М.р. – Ангарск, 2002

3. Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высшая школа, 1973. – 215 с.

5. Способ моделирования гипоксической энцефалопатии. RU 2253152 С2, 03.07.2003.

3. – С.47-54.

Формула изобретения

Способ диагностики отдаленной энцефалопатии у мелких лабораторных животных путем изучения показателей поведенческой активности у животных опытной и контрольной групп, отличающийся тем, что диагностируют отдаленную токсическую энцефалопатию, при этом регистрацию полученных результатов проводят дважды в динамике постконтактного периода: 1-й срок сразу после окончания воздействия парами металлической ртути, 2-й срок – спустя 9 недель, фиксируют у животных показатели: количество и длительность актов “норка”, стойка с упором, грумминг, время удержания на вращающемся стержне, количество животных, атакующих чужака; проводят оценку результатов в сравнении с контрольной группой и при уменьшении во 2-й срок обследования количества актов “норка” свыше 22%, длительности актов “норка” свыше 45%, количества животных, выполняющих акт стойка с упором, свыше 40%, возрастании длительности актов грумминг в 4,5 раза и более, увеличении количества животных, атакующих чужака, в 1,9 раза и более, времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более диагностируют отдаленную токсическую энцефалопатию.