Патент на изобретение №2383020

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕФРОПАТИИ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии. Для диагностики нефропатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани. При значениях МДА 8,65±0,47 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и головного вещества почечной ткани соответственно 4,39±0,18 и 6,62±0,17 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани 3,18±0,22 и 4,38±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в микросомальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,01±0,048 и 3,25±0,039 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в митохондриальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 1,09±0,029 и 1,9±0,053 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют диабетическую нефропатию при аллоксановом диабете. Способ позволяет расширить представление о патогенетических механизмах развития нефропатии. 3 табл., 8 ил.

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов развития диабетической нефропатии.

В развитии структурно-функциональных аномалий, лежащих в основе диабетических ангио- и нефропатии и ассоциированных с ними патологий (изменения свертывающей системы крови, артериальной гипертензии), участвует множество взаимосвязанных между собой процессов. Одним из таких нарушений является дисбаланс окислительно-восстановительных процессов и усиление неконтролируемых свободно-радикальных реакций (СРО), называемых окислительным стрессом (Baynes JW, 1991; Tesfamariam В, 1994; Van Damn PC, Van Asbeck BS, Erkelens, 1995). Проявляются системные метаболические расстройства, характер и направленность которых позволяют предполагать, что повышение интенсивности СРО мембранных фосфолипидов приводит к накоплению токсических продуктов окислительной деструкции липидов, изменению проницаемости сосудов вследствие дисфункции эндотелия, нарушению функциональной способности мембранных структур, активности мембранных ферментов клеточного метаболизма (Колесниченко Л.С., Мантарова Н.С., Шапиро Л.А., 1989; Гонский Я.И., Корда М.М., Клищ И.Н., Фира Л.С., 1996; Васильева О.В., Мобицкий О.Б., Клебанова Г.К., Владимиров Ю.А., 1998).

У заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: у животных с экспериментальным сахарным диабетом изучают активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида (МДА) в мембранах эритроцитов и почечной ткани и одновременно активность Na⁺, К⁺-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 8,65±0,47 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществах почечной ткани соответственно 4,39±0,18 и 6,62±0,17 нмоль/мг белка и более и значениях активности Nа⁺, К⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществах почечной ткани 3,18±0,22 и 4,38±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в микросомальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,01±0,048 и 3,25±0,039 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в митохондриальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 1,09±0,029 и 1,9±0,053 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют диабетическую нефропатию.

Эритроциты являются универсальными представителями тканевых клеток, поэтому изменение содержания МДА в эритроцитах отражает содержание его в других клетках, в частности в клетках почечной ткани. Т.е. изменение концентрации МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани однонаправлены, поэтому этот показатель можно использовать для диагностики свинцовой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа диагностики нефропатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных.

Решение этой задачи позволяет расширить представление о патогенетических механизмах развития нефропатии при экспериментальном сахарном диабете у животных.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение «Способ диагностики нефропатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных» включает следующие существенные признаки: у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию МДА и одновременно активность Na⁺, K⁺-ATФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 8,65±0,47 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществах почечной ткани соответственно 4,39±0,18 и 6,62±0,17 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, К⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществах почечной ткани 3,18±0,22 и 4,38±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в микросомальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,01±0,048 и 3,25±0,039 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в митохондриальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 1,09±0,029 и 1,9±0,053 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют диабетическую нефропатию.

Между признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: при вышеуказанных концентрациях МДА в мембранах эритроцитов и гомогенатах почечной ткани и активности Na⁺, K⁺-ATФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани отмечается нарушение водо- и электролитовыделительной функции почек, т.е. развивается диабетическая нефропатия.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанный способ диагностики диабетической нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном способе диагностики нефропатии при аллоксановом диабете. Учитывая то, что эритроцит является наиболее доступной моделью для исследования в организме животных и человека и процессы перекисного окисления липидов в нем протекают аналогично тканевым, содержание МДА в эритроцитах можно использовать для диагностики диабетической нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Все это позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом. Животным на фоне голодания однократно вводят внутрибрюшинно 5% водный раствор аллокеана в дозе 15 мг/кг массы тела. Через 48-72 часа отмечается повышение уровня сахара в крови (забор крови осуществляли из хвоста (микроколичество) и определяли уровень гликемии глюкооксидазным методом). Модель считалась состоявшейся при повышении сахара крови и диуреза в 2 раза.

Животных брали в опыт по истечении остротоксического периода действия аллоксана, т.е. спустя 14 дней с момента развития экспериментального сахарного диабета.

По истечении срока эксперимента для изучения активности ПОЛ и Na⁺, K⁺-ATФ-азы крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА. Производилось вскрытие брюшной полости, накладывались зажимы на почечные артерии и извлекались почки, которые для изучения активности Nа⁺, К⁺-АТФ-азы помещались в ступки со льдом (t=+4°С). Активность перекисного окисления липидов изучалась по концентрации МДА (конечного продукта ПОЛ) по методу Osacawa Т., активность Nа⁺, К⁺-АТФ-азы – по приросту неорганического фосфора в среде инкубации.

Пример 1. Крысам-самцам Линии Wistar однократно вводят водный раствор аллоксана в расчете 15 мг/кг массы тела. Через 48-72 часа отмечается повышение уровня сахара в крови (забор крови осуществляли из хвоста (микроколичество) и определяли уровень гликемии глюкооксидазным методом). Модель считалась состоявшейся при повышении сахара крови и диуреза в 2 раза.

По истечении срока эксперимента (спустя 14 дней с момента развития экспериментального сахарного диабета) изучали функциональное состояние почек: диурез, клубочковую фильтрацию, канальцевую реабсорбцию воды, экскрецию натрия и калия, их фильтрационные заряды и относительную канальцевую реабсорбцию натрия; определяли концентрацию МДА в эритроцитах, изучали активность Nа⁺, К⁺-АТФ-азы в гомогенатах слоев почечной ткани, микросомальной и митохондриальной фракциях. Сравнение полученных в ходе эксперимента данных проводили с группой интактных животных (контрольная группа).

Сущность заявляемого способа подтверждена графически, где на чертежах изображено:

фиг.1 – спонтанный диурез при аллоксановом диабете;

фиг.2 – скорость клубочковой фильтрации при аллоксановом диабете;

фиг.3 – канальцевая реабсорбция воды при аллоксановом диабете;

фиг.4 – экскреция натрия при аллоксановом диабете;

фиг.5 – фильтрационный заряд натрия при аллоксановом диабете;

фиг.6 – канальцевая реабсорбция натрия при аллоксановом диабете;

фиг.7 – экскреция калия при аллоксановом диабете;

фиг.8 – фильтрационный заряд калия при аллоксановом диабете.

Представлен анализ полученных результатов, который показал, что в хронической стадии АД уже при уровне гипергликемии до 10 ммоль/л отмечается статистически достоверное (p<0,001) увеличение спонтанного диуреза с 0,14±0,16 мл/ч/100 г веса в контрольной группе до 0,32±0,06 мл/ч/100 г веса в опытной, а при АД средней степени тяжести величина диуреза повышается с 0,14±0,16 мл/ч/100, г веса до 0,27±0,03 мл/ч/100 г веса (p<0,001) (фиг.1). Следовательно, при экспериментальном сахарном диабете имеет место статистически достоверное увеличение величины спонтанного диуреза.

Для выяснения механизма увеличения экскреции воды в условиях инсулиновой недостаточности у крыс мы исследовали состояние основных процессов мочеобразования (фиг.2, 3). При аллоксановом диабете (АД) легкой степени тяжести (I группа) отмечается тенденция к снижению КФ (p>0,05), а у животных с экспериментальным сахарным диабетом средней тяжести (II группа) не обнаружено достоверных изменений процессов клубочковой фильтрации (p>0,05) (фиг. 2). Поскольку определяющим величину диуреза фактором является уровень канальцевой реабсорбции воды, нами исследовался этот показатель, который выявил высоко достоверное снижение уровня канальцевой реабсорбции воды как при АД легкой, так и средней степени тяжести сахарного диабета (фиг.3).

На фиг.4 представлено, что повышенное мочевыделение сопровождается увеличением экскреции с мочой натрия. Поскольку натрий свободно фильтруется в почечных клубочках и почти 99% его вновь реабсорбируется в анальцах почек, следовательно, повышенная экскреция натрия может быть результатом увеличенной фильтрационной загрузки нефрона или пониженной канальцевой реабсорбции.

Данные, приведенные на фиг.4, демонстрируют увеличение экскреции натрия с мочой в обеих группах экспериментальных животных: так в I группе экскреция натрия статистически достоверно (p<0,001) увеличивается с 8,57±0,81 мкмоль/ч/100 г веса в контроле до 29,67±10,18 мкмоль/ч/100 г веса при аллоксановом диабете легкой степени тяжести, а при АД средней степени тяжести соответственно с 8,57±0,81 мкмоль/ч/100 г веса до 12,25±1,77 мкмоль/ч/100 г веса (p<0,05). При этом происходит уменьшение фильтрационного заряда у опытных животных с легкой формой сахарного диабета (I группа) с 3738,6±199,6 мкмоль/ч/100 г веса до 3355,8±467,6 мкмоль/ч/100 г веса, а при АД средней степени тяжести (II группа) до 3567,6±562,7 мкмоль/ч/100 г веса (фиг.5).

Однако анализ данных канальцевой реабсорбции натрия показал статистически достоверное (p<0,001) снижение уровня относительного обратного трансканальцевого всасывания натрия (фиг.6). Причем канальцевая реабсорбция натрия уменьшается в обеих опытных группах: статистически достоверно в первой группе у крыс с экспериментальным сахарным диабетом легкой степени тяжести – с 99,76±0,02% в контроле до 99,18±0,28% при диабете (p<0,001), во второй группе крыс с экспериментальным сахарным диабетом средней степени тяжести – с 99,76±0,02% до 99,36±0,05% (p<0,001) (фиг.6).

Одновременно с увеличением выделения натрия повышается и экскреция калия с мочой. В первой группе обнаружено увеличение экскреции калия с 8,13±0,84 мкмоль/ч/100 г веса в контроле до 9,65±1,07 мкмоль/ч/100 г веса в опыте, во второй группе – соответственно с 8,13±0,84 мкмоль/ч/100 г веса до 8,81±1,19 мкмоль/ч/100 г веса у крыс с аллоксановым диабетом средней тяжести (фиг.7). На фоне повышенной экскреции не выявлено статистически достоверного изменения фильтрационного заряда калия (фиг.8). Однако выделение калия с мочой зависит не только от фильтрационного заряда данного катиона и его реабсорбции, но и от секреции его в дистальных канальцах.

Ответственным за процессы реабсорбции натрия является биомеханизм, функционирующий в тонком восходящем колене петли Генле и дистальных канальцах и представлен Na⁺, K⁺-ATФ-aзой. Поэтому нами исследовалась активность Nа⁺, К⁺-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового веществ почечной ткани. Данные показали снижение активности Na⁺, K⁺-ATФ-aзой в гомогенатах обоих слоев почечной ткани (табл.1). Так, в корковом веществе активность фермента снизилась с 4,39±0,18 мкмоль Рн/мг белка/ч до 3,18±0,22 мкмоль Рн/мг белка/ч (p<0,001), то есть на 27,3% по сравнению с контрольной группой; а в мозговом веществе на 35,6%, то есть с 6,62±0,17 мкмоль Рн/мг белка/ч в контрольной группе до 4,28±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч в опытной (p<0,002).

Таблица 1
Показатели активности Na+,K+-ATФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового веществ почечной ткани при аллоксановом диабете.
	Активность Na+, K+-ATФ-aзы в гомогенатах почечной ткани,
Группы животных
	мкмоль Рн/мг белка/ч
	В корковом веществе	В мозговом веществе
	М=4,39	М=6,62
Контрольная группа	m=±0,18	m=±0,35
	n=25	n=25
Группа с аллоксановым диабетом	М=3,18	М=4,38
m=±0,22	m=±0,13
n=25	n=25
=<0,001	=<0,002
Примечание: – достоверность результатов в опытной группе сравнительно с данными контрольной группы.

В другом варианте исследований нами проводилось определение активности Nа⁺, К⁺-АТФ-азы не только в гомогенатах коркового и мозгового веществ почек, но также в субклеточных фракциях: митохондриальной и микросомальной.

Анализ данных показал, что при инсулиновой недостаточности – аллоксановый диабет – отмечается снижение активности Na⁺, К⁺-АТФ-азы не только в гомогенатах коркового и мозгового вещества почек, но и в микросомальной фракции клеток (с 4,39±0,18 Рн/мг б/ч до 3,19±0,15 Рн/мг б/ч (корковое в-во) и с 6,62±0,07 Рн/мг б/ч до 4,69±0,08 Рн/мг б/ч (мозговое в-во) (табл.2). Эти нарушения активности Na-насоса могут быть вызваны нарушением фосфорилирования АТФ-азы и уменьшением субстрата АТФ, что и вызывает понижение активности ферментов в митохондриях и микросомах.

Таблица 2
Активность Nа+,K+-АТФ-азы в микросомах и митохондриях слоев почечной ткани (мкмоль Рн/мг белка/ч).
Группы животных	митохондрии	микросомы
	мозговое в-во	корковое в-во	мозговое в-во	корковое в-во
	M	2,72	1,89	4,5	3,29
контроль	±m	0,089	0,058	0,039	0,048
	n	25	25	25	25
	M	1,90	1,09	3,25	2,01
аллоксановый диабет	±m	0,053	0,029	0,039	0,048
	n	20	20	20	20

Учитывая тот факт, что митохондрии являются энергообразующими структурами клетки, нами определялась активность фермента в этих субклеточных структурах. Выявленное угнетение активности Nа⁺, К⁺-АТФ-азы можно объяснить нарушением энергообразования.

Одним из факторов, от которых зависит активность данного фермента, является состояние липидного микроокружения. Чтобы оценить роль ПОЛ в снижении активности Na⁺, K⁺-ATФ-aзы в наших экспериментах проводилось изучение системы свободнорадикального окисления в мембранах эритроцитов, как аналогах тканевых клеток, и в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани. Об активности ПОЛ мы судили по изменению концентрации МДА.

Анализ полученных результатов показал, что происходит активация системы свободно-радикального окисления, о чем свидетельствует значительное увеличение концентрации МДА в эритроцитах по сравнению с контрольной группой. В хронической стадии аллоксанового диабета отмечается повышение концентрации МДА с 6,87±0,45 нмоль/нл в контрольной группе до 8,65±0,47 нмоль/нл при аллоксановом диабете (p<0,001), то есть на 25,9% (табл.3). Изучение ПОЛ в гомогенатах слоев почечной ткани выявил значительное увеличение концентрации МДА в корковом веществе с 3,18±0,22 нмоль/мг белка в контрольной группе до 4,39±0,18 нмоль/мг белка при аллоксановом диабете (p<0,001), то есть на 38%. В мозговом же веществе содержание МДА при сахарном диабете возрастает на 26,6% (с 4,28±0,13 нмоль/мг белка в контроле до 6,62±0,17 нмоль/мг белка в опыте, p<0,05) (табл.3).

Таблица 3
Концентрация малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и интерстиции почечной ткани при аллоксановом диабет.
Группы животных	Концентрация МДА в эритроцитах (нмоль/клетку)	Концентрация МДА в интерстиции мозгового вещества почечной ткани (нмоль/мг белка)	Концентрация МДА в интерстиции коркового вещества почечной ткани (нмоль/мг белка)
Контрольная группа	М	6,87	4,28	3,18
±m	0,45	0,13	0,22
n	10	16	16
Аллоксановый диабет	М	8,65	6,62	4,39
±m	0,47	0,17	0,18
n	10	12	12
	<0,01	<0,001	<0,001
Примечание: – достоверность результатов опытной группы по сравнению с контролем.

Изменения процессов свободнорадикального окисления в эритроцитах и почечной ткани однонаправлены, что позволяет использовать показатель активности ПОЛ в эритроцитах для диагностики свинцовой нефропатии у людей.

Таким образом, отмечается активация ПОЛ в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, свидетельством чему является повышение концентрации МДА. В результате активации ПОЛ меняется липидное микроокружение фермента Na⁺, K⁺-ATФ-aзы. Это приводит к падению его активности, следствием чего и является нарушение электролитовыделительной функции почек. Т.е. использование в качестве диагностического критерия диабетической нефроангиопатии концентрации МДА в эритроцитах и в почечной ткани и активности Nа⁺, К⁺-АТФ-азы вполне обоснованно.

Формула изобретения

Способ диагностики нефропатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных, отличающийся тем, что у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 8,65±0,47 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и головного вещества почечной ткани соответственно 4,39±0,18 и 6,62±0,17 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани 3,18±0,22 и 4,38±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в микросомальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,01±0,048 и 3,25±0,039 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно, в митохондриальной фракции коркового и мозгового веществ почечной ткани 1,09±0,029 и 1,9±0,053 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют диабетическую нефропатию при аллоксановом диабете.

РИСУНКИ