Патент на изобретение №2382596

(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СОСУДОВ, ПИТАЮЩИХ ОПУХОЛЬ, В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к экспериментальной медицине и магнитно-резонансной томографии, может быть использовано в онкологии для диагностики и терапии злокачественных опухолей. Вводят животным с привитыми опухолями внутривенно 10% золь аскорбатферрита или цитратферрита от 0,02 мл до 0,2 мл в полиглюкине. Затем вводят магневист. Магнитно-резонансную томографию проводят с получением T₁-, Т₂– и Т₂*-взвешенных 3D изображений. Способ позволяет увеличить контрастность, яркость и продолжительность МРТ-изображений сосудов, питающих опухоль. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и магнитно-резонансной томографии (МРТ), может быть использовано в онкологии для диагностики и терапии злокачественных опухолей и метастазов различной локализации.

Образование сосудов, питающих опухоль, не является генетически обусловленным и происходит в зоне развивающейся опухоли в процессе неоангиогенеза из существующих в тканях капилляров. Для успешной доставки препаратов в процессе внутрисосудистой регионарной химиотерапии необходимо знать расположение сосудов, питающих опухоль.

Известны способы рентгенологического и компьютерного томографического обнаружения сосудов путем внутривенного введения иодсодержащих рентгеноконтрастных препаратов с последующими рентгенографическим и компьютерным рентгенографическим исследованиями [1-3].

Недостатком данных способов является:

– изображение опухоли обычно представлено на рентгенограммах в виде темных пятен, сливающихся с изображениями сосудов, что не создает истинной картины расположения сосудов, снижая достоверность результатов и диагностическую ценность данного способа.

Известен способ контрастирования сосудов путем введения магневиста (МРТ-позитивного контрастного препарата), полупериод нахождения которого в плазме составляет менее 15 минут, с последующим T₁ взвешенным изображением на магнитно-резонансных томограммах (прототип) [4]. Данный способ позволяет получить через 4 минуты и поддерживать до 30 минут яркость магнитно-резонансных изображений органов и тканей.

Недостатками прототипа являются:

– на МР-томограммах изображения опухоли и сосудов сливаются с фоном, что значительно снижает достоверность результатов исследования и их диагностическую ценность;

– короткий полупериод нахождения магневиста в плазме крови.

Задачей изобретения является создание более информативного способа обнаружения сосудов, питающих опухоль.

Указанная задача решается следующим образом:

– животному внутривенно вводят ферриты (аскорбатферрит или цитратферрит) в полиглюкине (МРТ-негативные контрастные препараты, подавляющие сигналы протонов нормальных тканей). Через 6 минут после введения визуализируются структуры опухолевых тканей и опухолевой капсулы с питающими опухоль сосудами в виде светлых изображений на темном фоне, контраст которых сохраняется в течение 40 часов (чертеж а, Табл.1).

Для увеличения яркости МРТ-изображений внутривенно вводят до 50% традиционной дозы магневиста (0,1 ммол/кг^-1), который усиливает сигналы тканей, не содержащих ферриты, и в течение 30 минут создает высокую яркость магнитно-резонансных изображений органов и тканей животного.

Заявленный способ осуществляется на самках мышей C57B1/6j с привитыми опухолями аденокарциномы молочной железы Ca 755, через 6-10 дней опухоли пальпируют. В период от 3 часов до 30 часов до проведения МРТ-сканирования (Табл. 2, 3) внутривенно вводят от 0,02 мл до 0,2 мл 10% золя аскорбатферрита в полиглюкине (Таблица 1). При этом повышается контраст изображений органов и тканей, структуры капсулы и сосудов, питающих опухоль (чертеж, a-d). Дополнительное внутривенное введение 0,01-0,05 ммол/кг^-1 магневиста за 6 минут до МРТ усиливает контраст и яркость изображений опухоли, капсулы и сосудов, питающих опухоли на томограммах (чертеж, b-е).

Полученные данные обрабатывают статистически по стандартизованным критериям, за достоверные принимают различия при <0,05 [6].

Прививку опухоли мышам и оценку полученных результатов проводят согласно рекомендациям по химиотерапии злокачественных опухолей [5].

80 мышам С57В1/6j весом 18-21 г, в возрасте 6-10 недель, разводки вивария ГУ РОПЦ им Н.Н. Блохина РАМН имплантируют под кожу правого второго соска 1×10⁶ клеток/мышь аденокарциному молочной железы Ca 755 в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия, pH 7,4, в объеме 0,2 мл. Через 6-10 дней после прививки из общего количества отбирают 70 мышей, размеры опухолей которых достигают 10-17 мм. Объем каждой опухоли вычисляют как V=0,5·(l·n²), где V – объем, l – длина, n – площадь опухоли. Мышей с привитыми опухолями делят на 6 групп: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Первая – контрольная группа 20 мышей, 2, 3, 4, 5 и 6 – опытные группы по 10 мышей в каждой.

Подготовка к магнитно-резонансному томографическому обнаружению сосудов, питающих опухоли, аденокарциномы молочной железы Ca 755 на мышах C57B1/6j.

Мышам контрольной группы за период от 6 минут до 30 часов перед магнитно-резонансной томографией внутривенно вводят по 1 мл полиглюкина. Мышам опытных групп за такой же период времени внутривенно вводят от 0,01 до 0,1 мл 10% золя аскорбатферрита или от 0,01 до 0,1 мл 10% золя цитратферрита в полиглюкине и проводят сканирование на магнитном-резонансном биоспектротомографе BIOSPEC ВС 70/30 USR. (Bruker) в режимах T₁-взвешенных; Т₂*-взвешенных {500/15 [время повторения, мсек/время эхо, мсек] и Т₂-взвешенных (1900/80) спин-эхо и Т₂-взвешенных градиент-эхо (500/15)} изображений. Мониторинг жизнеобеспечения осуществляют с помощью Model 1025 smol Animal Monitoring and Gating System. (Operation Mammal) SA Instruments, Inc.

Предварительные опыты проводят на 2 мышах каждой группы: измеряют интенсивность сигнала и проводят визуальный анализ изображений на томограммах, определяя локализацию и структуру опухоли и сосудов, питающих опухоль.

1 (контрольная группа): при внутривенном введении 0,1 мл полиглюкина за 6 минут до магнитно-резонансной томографии отмечено незначительное увеличение яркости изображений без усиления контраста на томограммах, которое не обеспечивает обнаружение сосудов, питающих опухоли.

2 группа: внутривенное введение 0,01 мл 1% золя цитратферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-14 нм) за 6 минут до магнитно-резонансной томографии вызывает незначительное усиление контраста изображений на томограммах, которое не обеспечивает обнаружение сосудов, питающих опухоли.

3 группа: внутривенное введение 0,1 мл 1% золя аскорбатферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-14 нм) за 1 час до магнитно-резонансной томографии вызывает усиление контраста изображений на томограммах, которое обеспечивает обнаружение сосудов, питающих опухоли.

4 группа: внутривенное введение 0,1 мл 10% золя аскорбатферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-600 нм) за 24 часа до магнитно-резонансной томографии вызывает усиление контраста изображений на томограммах, которые обеспечивают обнаружение сосудов, питающих опухоли.

5 группа: внутривенное введение 0,1 мл 10% золя цитратферрита (диаметр наночастиц 6-24 нм) в полиглюкине за 13 часов до магнитно-резонансной томографии вызывает усиление контраста изображений на томограммах, которое обеспечивает обнаружение сосудов, питающих опухоли.

6 группа: внутривенное введение 0,4 мл 1% золя аскорбатферрита (диаметр наночастиц 6-260 нм) за 30 часов до магнитно-резонансной томографии и последующее внутривенное введение 0,004 мл магневиста за 4 минуты до магнитно-резонансной томографии вызывает усиление контраста и яркости изображений на томограммах, которое обеспечивает обнаружение сосудов, питающих опухоли.

Заявленный способ иллюстрируется примерами 1-6, чертеж (а-е) и таблицами 1-3.

Пример 1

За 6 минут до проведения магнитно-резонансной томографии в хвостовую вену мышей 1 группы вводят 0,1 мл полиглюкина, с последующим поочередным проведением T₁-, Т₂– и Т₂*-взвешенных 3D сканирований в течение 30 часов. На томограммах отмечаются увеличение контраста и незначительное повышение яркости МРТ-изображений. Сосуды, питающие опухоль, не определяются.

Пример 2

В хвостовую вену мышей 2 группы за 20 часов до томографии вводят 0,1 мл 10% золя аскорбатферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-600 нм). Проводят T₁-, T₂– и Т₂*-взвешенные 3D сканирования. При визуальном анализе структуры опухолей на томограммах обнаруживаются сосуды, питающие опухоль, яркость изображений низкая (чертеж, a, b).

Пример 3

В хвостовую вену мышей 3 группы за 20 часов до томографии вводят 0,2 мл 1% золя аскорбатферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-30 нм) и за 4 минуты до сканирования внутривенно вводят 0,05 ммол/кг^-1 магневиста. Затем получают T₁-, T₂– и Т₂*-взвешенные 3D изображения. На томограммах сохраняются контраст и яркость изображений, обнаруживаются сосуды, питающие опухоли (чертеж, b, с).

Пример 4

За 26 часов до томографии в хвостовую вену мышей 4 группы вводят 0,04 мл 10% золя аскорбатферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6 – 600 нм) и за 6 минут до сканирования внутривенно вводят 0,003 мл магневиста. Получают Т₂– и Т₂*-взвешенные 3D изображения. На томограммах выявлено усиление контраста и яркости изображений, обнаруживаются сосуды, питающие опухоли (чертеж, b, с).

Пример 5

За 30 часов до магнитно-резонансной томографии в хвостовую вену мышей 5 группы вводят 0,1 мл 10% золя цитратферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-24 нм) и за 8 минут до сканирования внутривенно вводят 0,003 мл магневиста с последующим получением и Т₂-, T₂*-взвешенных 3D изображений. На томограммах отмечают стабилизацию яркости изображений, обнаруживаются сосуды, питающие опухоли (чертеж, b-d).

Пример 6

За 40 часов до магнитно-резонансной томографии в хвостовую вену мышей 6 группы вводят 0,04 мл 10% золя аскорбатферрита в полиглюкине (диаметр наночастиц 6-600 нм) и за 10 минут до сканирования внутривенно вводят 0,05 ммол/кг^-1 магневиста с последующим получением Т₂-, Т₂*-взвешенных 3D изображений. Отмечено повышение интенсивности сигнала, повышение контраста и яркости МРТ-изображений опухолей на томограммах (чертеж, a-d), обнаруживаются поверхностные и глубинные сосуды, питающие опухоли: чертеж, (а) – два сосуда, питающие опухоль, (стрелки); чертеж, (b) – капсула (короткая черная стрелка), с которой соединены два деформированных сосуда, питающие опухоль (белые стрелки), которые заканчиваются в стенках капсулы, в опухолевой ткани встречаются функционирующие сосуды (длинная черная стрелка); (с) – яркая кровь, обогащенная магневистом, поступает из сосуда (черная стрелка), питающего опухоль, в капсулу (белые маленькие стрелки); (d) – обогащенная магневистом кровь поступает из сосудов, питающих опухоль (белые стрелки), в сосуды капсулы (черная стрелка); (e) – деформированная часть сосуда, питающего опухоль, поражена опухолевыми клетками (стрелка).

Усиление четкости изображений при магнитно-резонансной томографии за счет повышения контраста и яркости при внутривенном введении аскорбатферрита или цитратферрига и магневиста достижимо при условии подбора соответствующих количественных соотношений вводимых контрастных препаратов, очередности и временных интервалов их введения, поскольку возможно взаимное гашение яркости и размывание контраста, что приводит к нечетким малоинформативным МРТ-изображениям.

Для получения высокоинформативных МРТ-изображений последовательность введения и количественные соотношения аскорбатферрита, цитратферрита и магневиста определяют по таблицам 1-3.

Таблицы (1-3):

– (1) зависимость контраста и яркости изображений на томограммах от введенных препаратов;

– (2) зависимость контраста и яркости изображений на томограммах от временного интервала, прошедшего после введения контрастных препаратов: цитратферрит 0,2 мл, 10%; аскорбатферрит 0,2 мл, 10%; магневист 0,05 ммол/кг^-1;

– (3) зависимость контраста и яркости изображений на томограммах от времени, прошедшего после введения контрастных препаратов: цитратферрит 10% 0,2 мл; аскорбатферрит 10% 0,2 мл; магневист 0,05 ммол/кг^-1.

При внутривенном введении золей аскорбатферрита и цитратферрита проникновение наночастиц в опухоль и в метастазы затруднено. Из-за повышенного внутриопухолевого давления и атипичного строения сосудов, питающих опухоли. Наночастицы концентрируются в капсуле, окружающей опухоль. Концентрация ферритов в опухоли и метастазах повышается значительно медленнее, чем в нормальных тканях. В связи с чем увеличивается магнитная гетерогенность и разность между величинами сигналов опухолевых и нормальных тканей, усиливающих контраст изображений на томограммах. Усиление контраста изображений на томограммах биологических тканей наночастицами заявленных ферритов позволяет наблюдать изменения морфологии капсулы и сосудов, питающих опухоль, в реальном времени (чертеж, а-е), которые подтверждаются результатами патоморфологических и гистопатологических исследований.

Для подтверждения обнаруженных опухолей и сосудов, питающих опухоль, проводят сравнительное изучение данных патоморфологических и гистопатологических исследований с результатами магнитно-резонансной томографии. Кусочки тканей, взятые из мест расположения опухолей и сосудов, питающих опухоли, имплантированные под кожу мышам, вызывают рост аденокарциномы молочной железы Ca 755 у сингенных животных. При усилении контраста и яркости изображений на томограммах биологических тканей наночастицами аскорбатферрита в комбинации с магневистом обнаруживаются опухоли, капсулы, сосуды, питающие опухоли (чертеж, a-d), и инвазия опухолевых клеток в стенки сосуда, питающего опухоль (чертеж, е). Подтвержденные патоморфологическими и гистопатологическими методами данные магнитно-резонансной томографии используют для коррекции планов терапии опухолей.

Для одновременного достижения требуемых контраста и яркости изображений за 6 минут-40 часов до магнитно-резонансной томографии вводят 10% золи аскорбатферрита 0,2 мл; цитратферрита 0,2 мл в полиглюкине и дополнительно за 4-12 минут перед магнитно-резонансной томографией вводят магневист 0,05 ммол/кг^-1.

Чертеж (а, b, с, d, e). (а, b, с, d) МРТ-изображения опухолей аденокарциномы молочной железы Ca 755 у мышей С57В1/6j: (а) – капсула, содержащая опухоль, видны 2 сосуда, питающие опухоль, (стрелки); (b) – два деформированных сосуда, питающие опухоль (белые стрелки), которые заканчиваются в стенках капсулы (короткая черная стрелка), в опухолевых тканях встречаются функционирующие сосуды (длинная черная стрелка); (с) – поверхностный сосуд (черная стрелка), питающий опухоль, соединен с сосудами капсулы (белые маленькие стрелки), функционирующие глубинные опухолевые сосуды (тонкие черные стрелки); (d) – обогащенная магневистом яркая кровь поступает из сосудов, питающих опухоль (белые стрелки), в капсулу (черная стрелка) и в функционирующие глубинные опухолевые сосуды (тонкие черные стрелки); (е) – деформированная часть сосуда, питающего опухоль, поражена опухолевыми клетками (стрелка).

Технический результат заявленного способа состоит в увеличении:

– контраста и яркости МРТ-изображений сосудов, питающих опухоль;

– продолжительности и эффективности получения МРТ-изображений сосудов, питающих опухоль.

Это позволяет изучить структуру и функциональное состояние сосудов, питающих опухоль, для направленной доставки препаратов в процессе регионарной химиотерапии и оценить ее эффективность. По результатам МРТ планируют объем оперативных вмешательств, лучевых и химиотерапевтических воздействий, что приводит к снижению диагностических и терапевтических ошибок.

Источники информации

1. Долгушин Б.И. Методы лучевой диагностики в онкологии. Энциклопедия клинической онкологии. Главный ред. Давыдов М.И. Москва, РЛС-2004, 30-33.

2. Ширяев С.В. Ядерная медицина в онкологии. Энциклопедия клинической онкологии. Главный ред. Давыдов М.И. Москва, РЛС-2004, 117-125.

3. Летягин В.П. Злокачественные образования молочной железы у женщин и мужчин. Энциклопедия клинической онкологии. Главный ред. Давыдов М.И. Москва, РЛС-2004, 374-389.

4. Тютин Л.А., Шимановский Н.Л., Трофимова Т.Н. 15 лет клинического применения магневиста – первого магнитно-резонансного средства. Медицинская визуализация 2004, 3, 125-133.

5. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. Мед. Лит. М., 1962.

6. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных, Медиа Сфера, Москва (2002).

Таблица 1
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СОСУДОВ, ПИТАЮЩИХ ОПУХОЛЬ, В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Оп.	Аскорбатферрит 10% (мл)	Цитратферрит 10% (мл)	Магневист (ммол/кг-1)	Контраст	Яркость
1	–	0,1	–	Высокий	Низкая
2	0,18	–	–	Высокий	Низкая
3		–	0,1	Низкий	Высокая
4	0,1	–	–	Высокий	Низкая
5	–	0,06	0,03	Высокий	Средняя
6	0,06	–	0,04	Высокий	Средняя
7	–	0,02	0,09	Средний	Высокая
8	0,08	–	0,05	Высокий	Высокая
9	–	0,08	0,05	Высокий	Высокая
10	0,03	–	0,04	Средний	Средняя
11	0,02	–	0,04	Низкий	Средняя
12	–	0,05	0,05	Средний	Высокая
13	–	–	0,09	Низкий	Высокая
14	0,18	–	0,05	Высокий	Высокая
15	–	0,06	0,12	Средний	Высокая
16	–	–	0,004	Низкий	Низкая
17	0,16	–	0,1	Высокий	Высокая
18	–	0,2	0,2	Высокий	Высокая
19	0,2	–	0,008	Высокий	Низкая

Таблица 2
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СОСУДОВ, ПИТАЮЩИХ ОПУХОЛЬ, В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Опытов	Цитратферрит 0,2 мл, 10%, (час)	Аскорбатферрит 0,2 мл, 10% (час)	Магневист 0,05 ммол/кг-1 (мин)	Контраст	Яркость
1	20	–	–	Высокий	Низкая
2	25	–	–	Высокий	Низкая
3	30	–	–	Высокий	Низкая
4	10	–	10	Средний	Высокая
5	40	–	–	Средний	Низкая
6	–	5	5	Высокий	Высокая
7	–	10	7	Высокий	Высокая
8	–	15	9	Высокий	Высокая
9	–	3	28	Высокий	Средняя
10	–	30	26	Высокий	Средняя
11	–	45	38	Низкий	Низкая
12		60	45	Низкий	Низкая
13	–	–	7	Низкий	Высокая
14	–	–	15	Низкий	Высокая
15	–	–	12	Низкий	Высокая
16	21	7	5	Высокий	Высокая
17	18	13	4	Высокий	Высокая
18	8	6	7	Высокий	Высокая
19	–	–	60	Низкий	Низкая

Таблица 3
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СОСУДОВ, ПИТАЮЩИХ ОПУХОЛЬ, В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Опытов	Цитратферрит 0,2 мл, 10% (час)	Аскорбатферрит 0,2 мл, 10% (час)	Магневист 0,05 ммол/кг-1 (мин)	Контраст	Яркость
1	22	–	–	Высокий	Низкая
2	26	–	–	Высокий	Низкая
3	30	–	–	Высокий	Низкая
4	15	–	–	Высокий	Низкая
5	45	–	–	Средний	Низкая
6	–	8	–	Средний	Высокая
7	–	13	4	Средний	Высокая
8	–	17	5	Высокий	Высокая
9	–	6	6	Средний	Высокая
10	–	28	24	Высокий	Средняя
11	–	33	22	Высокий	Средняя
12	–	60	–	Низкий	Низкая
13	–	–	6	Низкий	Высокая
14	–	–	10	Низкий	Высокая
15	–	–	12	Низкий	Высокая
16	26	6	8	Высокий	Высокая
17	28	10	6	Высокий	Высокая
18	10	8	5	Средний	Высокая
19	60	60	60	Низкий	Низкий

Формула изобретения

Способ обнаружения сосудов, питающих опухоль, путем внутривенного введения магневиста с последующей магнитно-резонансной томографией, отличающийся тем, что предварительно внутривенно вводят 10% золь аскорбатферрита или цитратферрита от 0,02 до 0,2 мл в полиглюкине, а магнитно-резонансную томографию проводят с получением T₁-, Т₂– и Т₂*-взвешенных 3D-изображений.

РИСУНКИ

TH4A – Переиздание описания изобретения к патенту Российской Федерации

Причина переиздания: Коррекция в тексте реферата, формулы и описания изобретения

Извещение опубликовано: 10.06.2010 БИ: 16/2010