Патент на изобретение №2381272

(54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. Способ размножения вируса предусматривает культивирование пермиссивных клеток на нерастворимом пористом носителе, их дальнейшее инфицирование вирусом с последующим его размножением внутри клеток, прикрепленных к носителю. При этом в качестве пермиссивных клеток используют клетки человека или животных, функцию инфицирующего вируса выполняет вирус, способный к репродукции в таких клетках, а в качестве нерастворимого пористого носителя применяют полимерный криогель с сообщающимися порами сечением 50-500 мкм. В результате реализации предлагаемого изобретения достигается эффект исключения нежелательного «забивания» пор носителя растущей культурой и клеточным дебрисом, обеспечивается большая универсальность способа в отношении типов пермиссивных клеток, более эффективно используются весь объем носителя и культуральная среда, снижается опасность нарушения стерильности, снижается себестоимость целевого продукта, повышается выход целевого вируса. Изобретение может быть использовано в прикладной вирусологии, производстве вакцин, нанобиотехнологии, молекулярной биологии и других областях науки и техники, где существует необходимость получения препаративных количеств вирусного материала. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к процессам, связанным с получением вирусов, а именно к способу их размножения. Изобретение может быть использовано в прикладной вирусологии, производстве вакцин, нанобиотехнологии, молекулярной биологии и других областях науки и техники, где существует необходимость получения препаративных количеств вирусного материала.

Традиционные способы получения вирусов включают следующие основные операции: культивирование пермиссивной для данного вируса клеточной линии, инфицирование вирусом клеточной культуры, размножение вируса в организмах клеток-хозяев, сбор урожая вирусного материала вместе с клеточной культурой и культуральной средой [Вирусология в 3-х томах. / Под ред. Б.Филдс, Д.Найп. Москва, «Мир», 1989]. В результате этой последовательности операций получают вирусный материал, имеющий тот или иной титр, зависящий от эффективности процесса размножения вируса.

2287343; Б.И. 32 (2006)]. Применение этого известного способа позволяет повысить продуктивность биотехнологической системы в отношении целевого вируса, что после его очистки и инактивации обработкой пропиолактоном в результате приводит к более активной антирабической вакцине. Тем не менее, данное техническое решение тоже имеет определенные недостатки. Прежде всего, культивирование пермиссивных клеток на микроносителях возможно не для всех, а только для отдельных линий субстрат-зависимых клеток животных, человека или растений, т.е. этот способ не обладает достаточной универсальностью. Во-вторых, при перемешивании суспензии микроносителя с клетками, адгезионно-прикрепленными к поверхности его частиц, недостаточно прочно адсорбировавшаяся часть клеток смывается в культуральную среду, что снижает эффективность процесса в целом и загрязняет целевую вирусосодержащую жидкость посторонним биологическим материалом. В-третьих, при соударениях частиц микроносителя, а также в результате сдвиговых гидродинамических напряжений при перемешивании возможно разрушение осмотически слабых клеток, всегда присутствующих в составе популяции, что приводит прекращению размножения вируса в этих клетках (т.е. снижается выход вирусного материала) и к попаданию компонентов цитозоля и клеточного дебриса в культуральную жидкость, тем самым загрязняя ее нецелевыми ингредиентами.

₂. Клетки выращивают до состояния видимой глазом конфлюентности (обычно между 20 и 80 днями), причем в ходе культивирования биомасса получает регулярное питание посредством замены части отработанной среды на свежую среду с периодичностью не менее одного раза в неделю. Добавление свежей среды и удаление отработанной производят через специализированное отверстие биореактора (отверстие для подкормки и очистки). Вирус для инфицирования пермиссивных клеток вводится через то же отверстие. Сначала для оценки развития инфекции из биореактора отбирают образцы, а через 7-10 дней после инокуляции вируса отбирают размножившийся вирусный материал. Эту операцию осуществляют путем тщательного двукратного промывания клеток на мембране культуральной средой и далее пропусканием среды через мембрану, после чего продукт сохраняют для дальнейшего анализа. В результате получают препарат, представляющий собой культуральную среду, содержащую клеточный дебрис и вирус, титр которого составляет 2×10⁷ БОЕ/мл.

Для этого способа размножения вируса характерны достаточная защищенность пермиссивных клеток от внешних воздействий и технологичность самого процесса культивирования, позволяющая четко контролировать и поддерживать оптимальные параметры биотехнологической системы (рН и состав среды, температуру в биореакторе, концентрацию кислорода и др.), хорошие количественные показатели накопления клеточной биомассы и выхода продукта (высокий титр вирусного препарата), а также технологичность процесса сбора продукта (вирусного препарата).

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по состоянию клеточной биомассы при размножении в ней вируса (пермиссивные клетки адсорбированы на материале пористого полимерного носителя) выбрано нами за прототип.

Недостатками способа-прототипа являются:

1) всем носителям, выполненным в виде пористых полых волокон, свойствен такой общий недостаток, как постепенное «забивание» пор носителя растущей культурой и клеточным дебрисом, образующимся при отмирании части популяции внутри биореактора [А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд. МГУ. 1994. С.47]. Это приводит к постепенному нежелательному ухудшению гидродинамических характеристик материальных потоков в биотехнологической системе.

2) Универсальность способа-прототипа в отношении типов пермиссивных клеток также ограничена, поскольку многим субстрат-зависимым клеткам животных, человека или растений для прикрепления (адгезии) к материалу носителя необходима довольно ровная площадка для так называемого «распластывания», поэтому такие клетки не способны эффективно прикрепляться (а значит, и нормально функционировать) к сильно искривленной поверхности пористых полых волокон. Кроме того, для адгезии клеток к такому носителю используется только внешняя поверхность волокон, а большая площадь их пор клеткам не доступна вследствие микропористости материала носителя (размер пор не превышает 10 Å, или 0,001 мкм, при размерах клеток в единицы микрометров, т.е. в 10000 и более раз крупнее).

3) Выбор полимеров, из которых изготавливают подобные волокна, обычно используемые в модулях для ультрафильтрации и обратного осмоса, весьма ограничен (некоторые эфиры целлюлозы, поливинсульфон, полиамиды типа найлона), поэтому культивирование клеток, которым для адгезии на нерастворимом носителе нужны специфические «якорные» группировки, в случае реализации способа-прототипа малоэффективно, т.к. материал пористых полых волокон химически инертен и крайне сложно поддается модификации с целью введения таких группировок.

4) Оптимальный уровень работы биотехнологической системы, предусматриваемой в способе-прототипе, зависит от таких параметров, как концентрация клеток, рН среды, температура, насыщенность кислородом и др., контроль которых осуществляется не напрямую путем забора контрольных образцов (что требует разгерметизации соответствующего биореактора и сильно повышает опасность нарушения стерильности), а лишь косвенно через визуальные наблюдения и подбор оптимальных условий работы системы по выходу целевого вируса.

5) В способе-прототипе используется дорогостоящее оборудование, что существенно увеличивает себестоимость целевого продукта. Кроме того, после каждого цикла культивирования сам биореактор и его «обвязку» необходимо тщательно промывать и стерилизовать, что снижает технологичность системы в целом, особенно это касается нерастворимого носителя – блока используемых пористых полых волокон, промывка и стерилизация которых являются достаточно сложными технологическими операциями.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка более эффективного и универсального способа размножения вируса.

Указанная задача решается тем, что размножение вируса включает культивирование пермиссивных клеток на нерастворимом пористом носителе, их дальнейшее инфицирование вирусом с последующим его размножением внутри клеток, прикрепленных к носителю, причем в качестве пермиссивных клеток используют клетки человека или животных, функцию инфицирующего вируса выполняет вирус, способный к репродукции в таких клетках, а в качестве нерастворимого пористого носителя применяют полимерный криогель с сообщающимися порами сечением 50-500 мкм. При этом в качестве инфицирующего вируса, помимо природного вируса, может быть использован и рекомбинантный вирус или соответствующая генетическая конструкция, а нерастворимый пористый носитель может содержать якорные группировки или молекулы, обеспечивающие специфическое прикрепление пермиссивных клеток к поверхности стенок пор полимерного криогеля.

Выбор путей и режимов реализации, а также характеристик используемых материалов заявляемого способа обусловлен следующими факторами:

4, p.802-809 (2005)], в отношении клеток, в которых протекают процессы размножения вируса, подобное (т.е. предлагаемое) техническое решение ранее не было описано.

3) В качестве инфицирующего агента, который затем размножают согласно предлагаемому техническому решению, в заявляемом способе предусматривается использование как вируса человека или животных, способного инфицировать соответствующие пермиссивные клетки и далее размножаться в них (см. предыдущий пункт), так и использование рекомбинантных вирусов или соответствующих генетических конструкций, включающих полную нуклеотидную последовательность генома рекомбинантного вируса или ее фрагменты, также способных к генерации вирусных частиц с их последующим размножением в пермиссивной культуре клеток. В частности, изобретением предусматривается использование ДНК-содержащих рекомбинантных вирусов, таких как аденовирус человека или животных (например, аденовирус человека 5-го серотипа, аденовирус человека 35-го серотипа, аденовирус птиц FAV-1 (CELO), аденовирус собак 2-го серотипа CAV и др.), поксвирус (вирус осповакцины, вирус оспы канареек), и РНК-содержащих рекомбинантных вирусов, таких как ретровирус человека или животных и др.

1008214 (1982), Б.И. 2035476 (1994), Б.И. 2053796 (1992), Б.И. 2078099 (1994); Б.И. 2220987 (2001); Б.И. 10, p.445-451 (2003)]. Предлагаемое изобретение предусматривает использование второго из указанных типов криогелей в качестве носителей для культивирования пермиссивных клеток при размножении целевого вируса; при этом именно благодаря взаимосвязанной системе таких макропор появляется возможность колонизации (заселения) клеточной биомассой всего объема нерастворимого носителя. Заявляемый диапазон сечения пор выбран на основании экспериментов таковым, чтобы обеспечить условия свободного проникновения соответствующих пермиссивных клеток в объем пористого носителя, прикрепления клеток к стенкам макропор и последующего роста биомассы. При сечении пор менее примерно 50 мкм возникают стерические затруднения для указанных процессов, особенно в случае крупных пермиссивных клеток, а при сечении пор более примерно 500 мкм дальнейшее улучшение процесса заселения носителя уже не достигается, а площадь поверхности стенок макропор, доступная для прикрепления клеток, заметно уменьшается, что снижает эффективность биотехнологического процесса в целом.

Такое сочетание признаков, как совокупность используемых в заявляемом техническом решении операций процесса размножения вируса и применяемых для этого нерастворимых пористых носителей – полимерных криогелей, ранее известно не было, поэтому предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна».

Ниже приводится конкретный типичный пример реализации предлагаемого способа; остальные примеры, подтверждающие широту заявляемых его диапазонов, сведены в таблицу.

Пример. Размножение аденовируса Ad5-SEAP

а) Размножение вируса по стандартной методике (контроль)

Пермиссивные для аденовируса человека 5-го серотипа клетки линии 293 культивируют в 162 см²-культуральном флаконе в среде DMEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки. Затем 10⁴ клеток данной культуры, содержащиеся в объеме культуральной среды, равном 0,5 мл, вносят в культуральную пластиковую чашку диаметром 3 см, затем добавляют 1,5 мл питательной среды DMEM с 5% фетальной бычьей сыворотки. Клетки инкубируют в течение 24 часов при 37°С и 5% СО₂, после чего их инфицируют вирусом Ad5-SEAP в количестве 150 БОЕ/кл. Через 48 ч после инфекции, после наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживают для разрушения клеток и выхода вируса. Титр вируса Ad5-SEAP, содержащегося в культуральной среде, составляет 10⁸ БОЕ/мл.

б) Размножение вируса заявляемым способом

Пермиссивные для аденовируса человека 5-го серотипа клетки линии 293 культивируют в 162 см²-культуральном флаконе в среде DMEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки. Затем 5×10⁴2220987 (2001); Б.И. 4, P.802-809 (2005)]. Диаметр диска 3 см; его помещают в чашку Петри того же диаметра. Для адгезии клеток на носителе производят их инкубацию в течение 4 ч при 37°С и 5% CO₂. По истечении срока инкубации добавляют 1,5 мл питательной среды DMEM с 5% фетальной бычьей сыворотки (общий конечный объем среды составляет 2 мл). Затем клетки инкубируют в течение 6 дней при 37°С и 5% СО₂, производя ежедневный контроль динамики роста биомассы путем микроскопирования. На 6-й день инкубации клетки инфицируют вирусом Ad5-SEAP в количестве 150 БОЕ/кл. Через 48-96 ч после инфекции, после наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), криогель с клетками и культуральной средой трехкратно перемораживают для разрушения клеток и выхода вируса. В качестве стандарта при титровании используют культуральный препарат вируса Ad5-SEAP, полученный при инфекции того же количества клеток такой же дозой вируса. Титр вируса, полученного заявляемым способом и содержащегося в культуральной среде, составляет 5×10⁸ БОЕ/мл вируса Ad5-SEAP, что в 5 раз выше стандартной методики (см. 1а).

Таким образом, заявляемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1) в противоположность способу-прототипу заявляемое техническое решение избавлено от нежелательного эффекта постепенного «забивания» пор носителя растущей культурой и клеточным дебрисом. Это обусловлено как крупнопористостью используемого носителя (полимерный криогель с сообщающимися порами сечением 50-500 мкм), так и стационарным режимом культивирования пермиссивных для конкретного вируса клеток (т.е. отсутствием потоков жидкой среды в системе).

2) Поскольку развитая поверхность стенок макропор в полимерных криогелях имеет большую площадь участков малой степени кривизны, то заявляемый способ обладает существенно большей по сравнению с прототипом универсальностью в отношении типов пермиссивных клеток, т.к. в таком носителе имеются благоприятные условия (ровные площадки) для прикрепления (адгезии) субстрат-зависимых клеток к материалу носителя и их «распластывания». Кроме того, в заявляемом способе для адгезии клеток к такому носителю используется не только внешняя поверхность носителя, как в способе-прототипе, а большая площадь стенок макропор полимерного криогеля, т.е. более эффективно используется весь объем носителя и, как следствие, дорогая культуральная среда.

6, с.559-585 (2002)], так же как и очень широк известный набор методов введения туда необходимых якорных группировок, что также дополнительно повышает универсальность предлагаемого способа.

4) В отличие от прототипа, где контроль процесса культивирования клеток осуществляется не напрямую, а путем забора контрольных образцов (что требует разгерметизации соответствующего биореактора и сильно повышает опасность нарушения стерильности), в заявляемом техническом решении благодаря достаточной прозрачности носителя – полимерного криогеля – имеется возможность прямого наблюдения за ростом пермиссивных клеток простым методом оптической микроскопии.

5) Заявляемый способ не требует использования дорогостоящего оборудования, что существенно снижает себестоимость целевого продукта.

6) Универсальность заявляемого способа также подтверждается существенным увеличением в 3-5 и более раз выхода целевого вируса по сравнению со стандартным методом поверхностного культивирования пермиссивных клеток и размножаемого вируса в них (коэффициент К в таблице примеров) вне зависимости от типов клеток и вирусов (или генетических конструкций, включающих полную нуклеотидную последовательность генома рекомбинантного вируса или ее фрагменты).

7) К преимуществам предлагаемого технического решения также относится уменьшение (по сравнению с аналогами и прототипом) затрат на культуральную посуду и вещества, обеспечивающие клеточный рост и питание (в 3-5 раз снижаются затраты на вещества, обеспечивающие клеточный рост и питание, и до 5 раз на культуральную посуду).

8) Также оказалось, что при использовании заявляемого технического решения существенно (в 4-8 раз) сокращается срок получения вирусного препарата по сравнению с размножением вируса в клетках, культивируемых на пористых волокнах по способу-прототипу.

Формула изобретения

1. Способ размножения вируса, включающий культивирование пермиссивных клеток на нерастворимом пористом носителе, их дальнейшее инфицирование вирусом с последующим его размножением внутри клеток, прикрепленных к носителю, отличающийся тем, что в качестве пермиссивных клеток используют клетки человека или животных, функцию инфицирующего вируса выполняет вирус, способный к репродукции в таких клетках, а в качестве нерастворимого пористого носителя применяют полимерный криогель с сообщающимися порами сечением 50-500 мкм, культивирование клеток в матрице которого осуществляют в течение 5-6 суток, при этом инфицирующий вирус вносится в систему в количестве до 150 БОЕ/кл., а при снятии размножившегося вируса с носителя используют трехкратное перемораживание системы «вирус + клетка + криогель».

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что функцию инфицирующего вируса выполняет рекомбинатный вирус или соответствующая генетическая конструкция.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что нерастворимый пористый носитель содержит якорные группировки или молекулы, обеспечивающие специфическое прикрепление пермиссивных клеток к поверхности стенок пор полимерного криогеля.