Патент на изобретение №2380894
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЭКСПЛАНТОВ ЛИШАЙНИКА ИСЛАНДСКИЙ МОХ (Cetraria islandica (L.) ACH.)
(57) Реферат:
Экспланты лишайника Исландский мох (Cetraria islandica) сначала обрабатывают этанолом в концентрации от 3 до 98%, а затем – этаноловым экстрактом усниновой кислоты в концентрации 10-1000 мг/мл. При общем времени стерилизации в течение от 5 минут до 2 часов достигается значительное снижение поражения эксплантов контаминантными микроорганизмами без повреждения самих симбионтов лишайников. 1 табл.
Изобретение относится к области биологии, в частности к области биотехнологии, экспериментальной лихенологии, микробиологии, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, парафармацевтике, ветеринарии. Уровень техники Для высших растений разработаны методы стерилизации эксплантов (Бутенко Р.Г., 1999. Биология клеток растений in vitro и биотехнологии на их основе. – M: ФБК-пресс, 159 с.). В патентной и научно-технической литературе нет других упоминаний о стерилизации лишайниковых эксплантов. Задачей настоящего изобретения является создание нового способа стерилизации лишайниковых эксплантов, который обладает следующими качествами: снижает поражение эксплантов контаминантными микроорганизмами (минимум на 10%), не повреждает самих симбионтов лишайников. Поставленная задача решается созданием нового способа стерилизации эксплантов лишайника Исландский мох (Cetraria islandica}, заключающегося в в последовательной обработке лишайниковых эксплантов стерилизующими агентами, отличающейся тем, что в качестве стерилизующих агентов используют последовательную обработку этанолом (в концентрации от 3 до 98%) и этаноловым экстрактом усниновой кислоты (концентрация от 10 до 1000 мг/мл) при времени обработки от 5 минут до 2 часов Выход за пределы по последовательности использования специфических и неспецифических стерилизующих агентов и их концентрации приводит к следующим изменениям. При стерилизации менее 5 минут эффекта от обработки стерилизующими агентами не наблюдается, при чересчур длительной стерилизации (более 2 часов) возможно повреждение симбионтов лишайников. Использование этанола в концентрации ниже 3% неэффективно, а применение их в концентрациях выше 98 и 37% соответственно невозможно из-за отсутствия подобных растворов при нормальных условиях (данных растворов не бывает в природе). Суть изобретения заключается в использовании для поверхностной стерилизации комбинации этанола и этанолового экстракта усниновой кислоты. Поверхность слоевищ лишайников обильно заселена ассоциативными микроорганизмами. Большинство из них относится к тем же систематическим группам, что и симбионты лишайников, поэтому использование одних только специфических стерилизующих агентов не эффективно. Выходом является использование комбинации из этанола и этанолового экстракта усниновой кислоты. Изобретение подтверждается следующими примерами: Пример 1 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 3% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 60% инокулированных фрагментов (поражение составляет 60%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Пример 2 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 50% инокулированных фрагментов (поражение составляет 50%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Пример 3 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica} промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 98% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 40% инокулированных фрагментов (поражение составляет 40%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Пример 4 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 10 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 70% инокулированных фрагментов (поражение составляет 70%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Пример 5 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 1000 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 48% инокулированных фрагментов (поражение составляет 48%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Пример 6 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 1 час), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 1 час). Общее время стерилизации составляет 2 часов. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 37% инокулированных фрагментов (поражение составляет 40%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Пример 7 Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см2. Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 2 мин 30 с), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 2 мин 30 с). Общее время стерилизации составляет 5 минут. После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 70% инокулированных фрагментов (поражение составляет 70%; в контроле без обработки – 100%). Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников. Из результатов таблицы следует, что оптимальные условия стерилизации достигаются в примерах
Формула изобретения
Способ стерилизации эксплантов лишайника Исландский мох (Cetraria islandica), заключающийся в последовательной обработке лишайниковых эксплантов стерилизующими агентами, отличающийся тем, что обработку осуществляют последовательно этанолом в концентрации от 3 до 98% и этаноловым экстрактом усниновой кислоты с концентрацией от 10 до 1000 мг/мл при общем времени обработки от 5 мин до 2 ч.
|
||||||||||||||||||||||||||