Патент на изобретение №2166956

(54) СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ АНТИГЕННЕЗАВИСИМУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ B-ЛИМФОЦИТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и заключается в применении пептида формулы Tyr-Clu-Gly (L-тирозил-L-глутамил-L-глицин) в качестве средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов, используют синтетический пептид структурной формулы: L-тирозил-L-глутамил-L-глицин (Tyr-Glu-Gly). Изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов. 3 табл.

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и заключается в применении пептида формулы Tyr-Glu-Gly (L-тирозил-L-глутамил-L-глицин) в качестве средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Антигеннезависимая дифференцировка B-лимфоцитов представляет собой процесс образования функционально полноценных B-лимфоцитов из клеток-предшественников, который протекает на территории центральных органов иммунитета. Антигеннезависимая дифференцировка заканчивается образованием зрелого B-лимфоцита, имеющего определенные мембранные маркеры (иммуноглобулиновые рецепторы, антигены CD21, CD22 и др.), отсутствующие на ранних стадиях развития [1, 2]. Одним из механизмов развития иммунодефицита по B-системе иммунитета является угнетение антигеннезависимой дифференцировки B-лимфоцитов. Применение в таких случаях стимуляторов антигеннезависимой дифференцировки может привести к нормализации иммунного статуса организма.

Известен ряд веществ, обладающих способностью стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов. Впервые такое свойство было описано у экстрактов из центральных органов иммунитета – бурсы Фабрициуса птиц и костного мозга млекопитающих. Известны работы, в которых описывается экстракт из ткани сумки Фабрициуса птиц, способный стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов и представляющий собой грубый экстракт животного сырья, из которого не было выделено и идентифицировано активное начало [3, 4].

Методом уксуснокислой экстракции из ткани сумки Фабрициуса птиц выделено вещество, стимулирующее созревание B-лимфоцитов [5], которое представляет собой комплекс щелочных полипептидов с молекулярной массой от 2 до 12 кД, относящихся к классу “цитомединов” и названное впоследствии “бурсилин”. Данное вещество обладает низкой активностью и стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов в культуре клеток лишь в концентрации 100 мкг/мл [5, 6].

К стимуляторам антигеннезависимой дифференцировки B-клеток относятся и гемолимфопоэтические ростковые факторы, полученные из супернатанта культуры клеток костного мозга и имеющие белковую природу с ММ 110-140 кД, что придает веществу дополнительные аллергогенные свойства. Кроме того, данное вещество стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов лишь в концентрации от 5 до 10 мг/мл [7].

Вышеописанные вещества состоят из комплекса пептидов, которые способны стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов. Использование их в качестве лекарственных средств затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за возможности возникновения у больных побочных реакций вследствие присутствия в данных препаратах из сумки Фабрициуса и костного мозга балластных высокомолекулярных компонентов. Предпочтительнее использовать низкомолекулярные синтетические пептидные соединения. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах, не оказывают аллергогенного и токсического действия на организм.

Известен синтетический пептид, имеющий формулу Lys-His-Gly-NH₂ (L-лизил-L-гистидил-глицинамид), способный стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов [8] , выпускаемый под фирменным названием “бурсин” (“Sigma”, Швеция). Данное средство по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом.

Согласно прототипу, синтетический трипептид Lys-His-Gly-NH₂ дозозависимо и избирательно стимулирует дифференцировку предшественников B-клеток в зрелые B-клетки, другими словами стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, но не влияет на T-клеточную дифференцировку. Однако данный пептид обладает низкой биологической активностью. Так, максимальная активность вещества проявляется в концентрации 1 мкг/мл in vitro и 1 мг/кг веса тела при парентеральном введении in vivo.

Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, предлагаются использовать синтетический пептид структурной формулы L-тирозил-L-глутамил-L-глицин (Tyr-Glu-Gly).

Трипептид формулы Tyr-Glu-Gly был обнаружен нами в ткани сумки Фабрициуса – центральном органе гуморального иммунитета птиц и в дальнейшем синтезирован. Трипептид синтезировали твердофазным методом, путем наращивания пептидной цепи с N-конца.

При экспериментальном изучении биологической активности заявляемого вещества выявлена его способность стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Специфическую активность предлагаемого средства оценивали по способности последнего вызывать экспрессию дифференцировочных антигенов, являющихся маркерами зрелого B-лимфоцита. Уровень экспрессии дифференцировочных антигенов оценивали методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МкАТ) LT21, LT22 и CH2 (“Сорбент”, Москва) к дифференцировочным антигенам CD21, CD22 и IgM, являющихся маркером зрелой B-клетки – завершающего этапа антигеннезависимой дифференцировки B-лимфоцитов. Исследование проводили на лимфоцитах ожоговых больных, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается антигеннезависимая дифференцировка B-лимфоцитов и в периферической крови резко снижается количество зрелых форм B-клеток [9, 10]. Лимфоциты периферической крови больных с ожогами IIIб – IV степени 15 – 30% поверхности тела инкубировали в течение 2 часов при температуре 37^oC в полной питательной среде с исследуемым средством в концентрациях от 0,01 до 1 мкг/мл. В качестве контроля исследовали лимфоциты больных с ожогами с добавлением аналогичного объема физиологического раствора. Полученные данные представлены в таблицах 1 и 2.

Установлено, что у больных с ожогами снижено количество лимфоцитов, несущих поверхностный IgM. Предлагаемый пептид Tyr-Glu-Gly дозозависимо стимулирует экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов. Так, заявляемое средство эффективно в концентрациях от 0,05 до 1 мкг/мл, причем максимальная активность наблюдается при концентрации пептида 0,1 мкг/мл. В то же время известное средство бурсин проявляет аналогичную активность лишь в концентрации 0,5-1 мкг/мл. Таким образом, предлагаемое средство – синтетический пептид Tyr-Glu-Gly – увеличивает количество зрелых B-лимфоцитов, несущих IgM-рецепторы в дозах, в 10 раз меньших, чем бурсин.

Установлено, что у больных с ожогами снижено количество лимфоцитов, несущих маркеры зрелого B-лимфоцита CD21 и CD22. Инкубация лимфоцитов ожоговых больных с пептидом Tyr-Glu-Gly приводит к достоверному увеличению числа CD21⁺ и CD22⁺ клеток в концентрации от 0,05 до 1 мкг/мл, приближая эти показатели к нормальным, причем максимальная активность пептида Tyr-Glu-Gly наблюдается в концентрации 0,1 мкг/мл. В то же время известное средство бурсин проявляет свою активность лишь в концентрации 0,5-1 мкг/мл. Таким образом, пептид Tyr-Glu-Gly увеличивает количество зрелых B-лимфоцитов, несущих антигены CD21 и CD22 в дозах, в 10 раз меньших, чем бурсин.

Специфическую биологическую активность заявляемого средства изучали также в опытах in vivo на модели эмбриональной бурсэктомии. Известно, что в сумке Фабрициуса происходит антигеннезависимая дифференцировка B-лимфоцитов и ее удаление сопровождается нарушением этого процесса [6, 11]. При этом наблюдается выраженное угнетение гуморального иммунитета, что связано с отсутствием у бурсэктомированных птиц зрелых B-лимфоцитов, способных вовлекаться в иммунный ответ. Бурсэктомированные цыплята значительно отстают в росте и практически полностью погибают после 7-8 недели жизни.

Эмбриональную бурсэктомию выполняли хирургическим путем на 19 день эмбрионального развития, контрольная группа эмбрионов в эти же сроки подвергалась ложной операции с воспроизведением всех этапов оперативного вмешательства за исключением удаления бурсы Фабрициуса.

Начиная с месячного возраста в течение недели бурсэктомированные цыплята внутримышечно получали пептид Tyr-Glu-Gly и бурсин в дозах 0,01, 0,05, 0,1 и 1 мг/кг массы тела. Контролем служили бурсэктомированные цыплята, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме.

Количество зрелых B-лимфоцитов, имеющих поверхностные иммуноглобулины, определяли в реакции непрямой мембраной иммунофлуоресценции с использованием антител к куриным IgG -цепи) и легким цепям иммуноглобулинов курицы (“Sigma”, Швеция). Известно, что Ig-рецепторы являются дифференцировочным маркером B-клеток и определяются у B-лимфоцитов на заключительных этапах антигеннезависимой дифференцировки, но отсутствуют на стадии пре-B-клетки [12] . Полученные результаты приведены в таблице 3.

Установлено, что при эмбриональной бурсэктомии у цыплят резко снижается количество B-лимфоцитов, несущих на своей поверхности Ig-рецепторы , в частности мембранный IgG. Введение трипептида Tyr-Glu-Gly в дозах от 0,01 до 1 мг/кг веса бурсэктомированным птицам приводит к повышению количества зрелых B-лимфоцитов, имеющих Ig-рецепторы на своей поверхности, причем максимальная активность пептида Tyr-Glu-Gly зарегистрирована в концентрации 0,1 мг/кг веса тела. Аналогичный эффект достигается и введением бурсина в дозах от 0,1 до 1 мг/кг веса, а максимальная активность бурсина проявляется в концентрации 1 мг/кг веса тела цыпленка. Таким образом, пептид Tyr-Glu-Gly стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов в концентрациях, в 10 раз меньших, чем известный пептид Lis-His-Gly-NH₂.

У бурсэктомированных цыплят вследствие нарушения дифференцировки B-лимфоцитов значительно угнетается гуморальный иммунный ответ, развивается лейкопения, уменьшается вес тела и лимфоидных органов. Введение заявляемого пептида приводит к индукции антигеннезависимой дифференцировки B-клеток, увеличению количества функционально полноценных B-лимфоцитов, что выражается в нормализации иммунного ответа, возрастании числа лейкоцитов периферической крови, веса тела, селезенки и тимуса.

Результаты экспериментального изучения заявляемого средства свидетельствуют о его высокой специфической активности. Предлагаемый синтетический пептид Tyr-Glu-Gly оказывает выраженное стимулирующее действие на дифференцировку B-лимфоцитов. Это демонстрируется в следующих примерах.

Пример 1. Синтетический пептид Tyr-Glu-Gly стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов in vitro на модели лимфоцитов больных с ожогами.

Кровь больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела стабилизировали гепарином (25 Ед/мл). Лимфоциты периферической крови выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (плотность 1,077 г/мл). Количество клеток в суспензии при подсчете в камере Горяева составило 210⁶/мл, жизнеспособность клеток при окрашивании трипановым синим 98%.

Лимфоциты инкубировали в среде RPMI-1640 (“Flow”) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (“Flow”), 2 мМ L-глютамина (“Flow”), 40 мкг/мл гентамицина (“Фармахим”) и 5 мМ HEPES-буфера в течение 2 часов при температуре 37^oC. Трипептид Tyr-Glu-Gly добавляли в культуру лимфоцитов в концентрации 0,1 мкг/мл. В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме.

Уровень экспрессии дифференцировочных антигенов оценивали в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител анти-СD21, анти-СD22 и анти-IgM. В качестве вторых антител использовали антитела, меченные ФИТЦ (“Сорбент”, г.Москва).

Регистрацию зеленой флюоресценции ФИТЦ проводили с помощью микроскопа “ЕС Люмам-РПО 11” (окуляр х3, объектив х90) при подсчете минимум 200 клеток в препарате.

У больных с ожогами по сравнению со здоровыми донорами значительно снижается количество клеток, несущих на своей поверхности дифференцировочные антигены CD21 (с 8,9 0,8 до 5,9 0,9%), CD22 (с 9,9 0,9 до 5,6 1,1%) и IgM (с 7,9 0,5 до 4,7 0,6 %). При инкубации лимфоцитов ожоговых больных с пептидом Tyr-Glu-Gly достоверно увеличивалось количество зрелых B-лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные антигены CD21, CD22 и IgM, и составило соответственно 8,6 0,6% (p<0,01), 9,0 0,8% (p<0,01) и 7,2 0,6% (p<0,01).

Пример 2. Синтетический пептид Tyr-Glu-Gly стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов in vivo на модели эмбриональнрой бурсэктомии.

На 19 день инкубации эмбрионы цыплят-бройлеров породы “Леггорн” подвергали хирургической бурсэктомии в асептических условиях. В эти же сроки контрольную группу эмбрионов подвергали ложной операции с воспроизведением всех этапов оперативного вмешательства за исключением удаления бурсы Фабрициуса.

Начиная с 4-недельного возраста в течение недели бурсэктомированным цыплятам 1 раз в сутки внутримышечно вводили пептид Tyr-Glu-Gly в дозе 0,1 мг/кг массы тела. Контролем служили бурсэктомированные цыплята, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме.

Оценку эффективности антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов у экспериментальных животных производили в реакции непрямой мембраной иммунофлуоресценции с использованием антител к куриному IgG и легким цепям иммуноглобулинов курицы (“Sigma”, Швеция). Для этого у птиц по окончании курса лечения забирали кровь, стабилизировали гепарином (25 Ед/мл). Далее из гепаринизированной периферической крови выделяли лимфоциты путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин. Полученные клетки трижды отмывали средой 199 без ионов кальция при 37^oC. Жизнеспособность клеток в тесте с поглощением трипанового синего составила 96-98%. Затем лимфоциты инкубировали с моноклональными антителами против IgG и легких цепей иммуноглобулинов кур при температуре 37^oC в течение 30 минут. После этого клетки трижды отмывали PBS, инкубировали с ФИТЦ-мечеными антителами (“Sigma”, Швеция) в течение 30 минут при 4^oC, отмывали PBS. Клетки помещались на предметное стекло в смесь равных частей глицерина и PBS и исследовались под люминисцентным микроскопом “ЕС Люмам-РПО 11”. В каждом препарате подсчитывалось от 200 до 500 клеток.

При бурсэктомии наблюдается достоверное снижение числа общих sIg⁺ клеток, а также sIgG⁺ клеток. Так у ложнооперированных и эмбрионально бурсэктомированных птиц количество клеток, несущих поверхностный IgG, составило 9,6 0,9 и 3,4 0,5% (p<0,01), общий Ig 19,1 1,1 и 8,7 0,5% (p<0,01) соответственно. Установлено, что при введении пептида Tyr-Glu-Gly бурсэктомированным цыплятам увеличивается количество зрелых B-лимфоцитов, имеющих иммуноглобулиновые рецепторы. Число sIgG⁺ клеток возрастало с 3,4 0,5 в контроле до 7,8 0,6% в опыте (p<0,01), а количество sIg⁺ клеток с 8,7 0,5 до 14,6 0,7% (p<0,01), приближаясь к нормальным показателям, хотя и не достигая их.

По сравнению с известным средством Lis-His-Gly-NH₂ (прототип) заявляемый пептид Tyr-Glu-Gly способен стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов в дозах, в 10 раз меньших, что свидетельствует о его большей специфической активности. Уменьшение дозировки пептида для достижения аналогичного эффекта дает возможность уменьшить риск побочного влияния.

Таким образом, при экспериментальном изучении специфической активности заявляемого вещества установлено, что трипептид Tyr-Glu-Gly обладает свойством стимулировать антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Источники информации

5. Авторское свидетельство СССР N 1438044, МКИ⁵ A 61 K 39/00, 1985.

6. Степанов А.В. Полипептидные факторы из сумки Фабрициуса и их влияние на иммуногенез и гемостаз: Автореф. дис. канд. мед. наук. – Чита, 1988. – 22 с.

7. Патент США N 5264418, МКИ⁵ C 07 K 3/20, 1993.

8. Патент США N 4584284, МКИ⁴ A 61 K 37/24; C 07 K 5/08; C 08 F 283/00, 1986.

Формула изобретения

Применение пептида формулы Tyr-Glu-Gly (L-тирозил-L-глутамил-L-глицин) в качестве средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 13.04.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 32-2003

Извещение опубликовано: 20.11.2003