Патент на изобретение №2379685

(54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПРЕСС НСТ-ТЕСТА ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ СОБАК

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии. Способ проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови собак включает смешивание крови с растворенным нитросиним тетразолием (НСТ), инкубирование, микроскопирование и подсчет позитивных и негативных клеток. В пробирку вносится и перемешивается: 0,05 мл свежей гепаринизированной крови, 0,05 мл 0,2% раствора НСТ на фосфатносолевом буфере, затем инкубируется в течение 30 минут при Т=37°С, после окончания инкубирования в пробирку вносится 0,3 мл 3,5% раствора уксусной кислоты, тщательно перемешивается, отбирается аликвота полученной смеси и ею заряжается камера «Горяева», микроскопируются клетки под увеличением 40х10, при обеспечении минимальной контрастности неокрашенных клеток, дифференцированно подсчитываются НСТ-позитивные клетки, содержащие в цитоплазме крови кристаллы формазана, и НСТ-негативные клетки, не содержащие формазан. Изобретение обеспечивает создание простого, быстрого и экономичного способа проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови собак.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам диагностирования физиологического состояния организма с помощью исследований, включающих исследование биологического материала, например крови.

Известны способы проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови у людей и животных. НСТ-тест – это тест на фагоцитарную активность клеток, он выявляет, например, способность организма к уничтожению поглощенных микробов или разрушению внутриклеточного материала. Количественное соотношение НСТ-позитивных к НСТ-негативным фагоцитам после предварительной стимуляции клеток, например, продигиозаном отражает уровень защитных свойств организма (уровень иммунитета). Один из способов заключается в инкубировании капли крови (без антикоагулянта) на хорошо обезжиренном предметном стекле в течение 30 минут при T=37°C во влажной камере. Затем свернувшийся сгусток крови – мазок снимается с предметного стекла. Предметное стекло отмывается от остатков эритроцитов в физиологическом растворе. После этих действий на предметном стекле отчетливо видно серое пятно адгезированных лейкоцитов. На пятно наносится капля бесцветного красителя нитросинего тетразолия (НСТ) и прикрывается покровным стеклом. Повторяется инкубирование при тех же условиях. По окончании инкубирования покровное стекло снимается с предметного, пятно высушивается, фиксируется, окрашивается, микроскопируется и производится подсчет позитивных клеток-фагоцитов и число негативных клеток-фагоцитов. Количественное соотношение позитивных клеток-фагоцитов к числу негативных клеток-фагоцитов (после предварительной стимуляции клеток продигиозаном) отражает степень фагоцитарной потенции исследуемой суспензии, т.е. определяется уровень врожденного механизма защиты организма.

Рассмотренный способ категорически не подходит для исследования НСТ-теста у собак, т.к. лейкоциты их крови не обладают такими сильными адгезивными свойствами к поверхности предметного стекла.

Другой способ проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови заключается в инкубации крови раствором нитросинего тетразолия (НСТ), с последующим приготовлением мазков. Мазки высушивают, фиксируют, окрашивают, микроскопируют и подсчитывают количество позитивных и негативных клеток- фагоцитов. Количественное соотношение позитивных клеток-фагоцитов к числу негативных клеток-фагоцитов (после предварительной стимуляции клеток продигиозаном) отражает степень фагоцитарной потенции исследуемой суспензии и соответственно степень физиологического состояния организма.

Рассмотренный способ применяется в ветеринарии, но у него есть ряд недостатков. Во-первых, он требует значительных затрат времени, что немаловажно при работе с большим количеством проб. Во-вторых, способ повторяет процедуру приготовления мазков крови, которая и так, в обязательном порядке, делается при общем клиническом анализе крови. В-третьих, процедура подсчета НСТ-позитивных и НСТ-негативных клеток непосредственно в мазках крови требует больших затрат времени, особенно если у обследуемого животного имеет место лейкопения (см. 1. «Основы иммунологии. Лабораторный практикум», авторы Меньшиков И.В. и Бедулева Л.В., Издательский дом, «Удмурдский университет», Ижевск, 2001 год.; 2. Штельцнер А. «Фагоцитоз. Иммунологические методы» под редакцией Фримеля Г. Стр.378-390, Москва, «Мир», 1987 г.; 3. Роберт Ф., Эщмен «Активация лимфоцитов. Иммунология» под редакцией У.Пол. Т-1. Стр.414-466, Москва, «Мир», 1987 г.; 4. Патенты РФ 2033612 и 2012881, МПК G01N 33/48).

Задача изобретения – создание простого, быстрого и экономичного способа проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови собак.

Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови собак, включающем: смешивание крови с растворенным нитросиним тетразолием (НСТ), инкубирование, микроскопирование и подсчет позитивных и негативных клеток, предлагается в пробирку внести и перемешать: 0,05 мл свежей гепаринизированной крови, 0,05 мл 0,2% раствора НСТ на фосфатносолевом буфере, затем инкубировать в течение 30 минут при T=37°С, после окончания инкубирования в пробирку внести 0,3 мл 3,5% раствора уксусной кислоты, тщательно перемешать, отобрать аликвоту полученной смеси и ею зарядить камеру «Горяева», микроскопировать клетки под увеличением 40×10, при обеспечении минимальной контрастности неокрашенных клеток, подсчитать НСТ-позитивные клетки, содержащие в цитоплазме крови кристаллы формазана, и НСТ-негативные клетки, не содержащие формазан.

Способ проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови собак осуществляется следующим образом.

Сущность способа основана на восстановлении поглощенного активированным фагоцитом растворимого бесцветного красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан синего цвета. Количественное соотношение НСТ-позитивных фагоцитов периферической крови к НСТ-негативным отражает степень напряженности воспалительного процесса.

В пробирку типа Эпендорф вносим 0,05 мл свежей гепаринизированной крови. Туда же вносим 0,05 мл 0,2% раствора НСТ на фосфатносолевом буфере, перемешиваем смесь клеток с раствором НСТ и инкубируем 30 минут при t=37°С. По окончании инкубации, для остановки реакции восстановления НСТ и лизиса эритроцитов, вносим 0,3 мл 3,5% раствора уксусной кислоты, состав тщательно перемешиваем, отбираем небольшую аликвоту и заряжаем ею камеру «Горяева». Заполненную камеру микроскопируем под увеличением 40×10. Причем освещенность и высоту конденсера подбираем таким образом, чтобы максимально уменьшить контрастность неокрашенных клеток, что может имитировать примембранные отложения кристалов формазана. Подсчет проводим обычным способом. Дифференцированно подсчитываются НСТ-позитивные клетки (содержащие в цитоплазме кристалы формазана) и НСТ-негативные клетки (не содержащие формазан). При нормальном заполнении камеры клетками подсчет проводим в 25 больших квадратах. Количество НСТ-позитивных клеток, сосчитанных в 25 больших квадратах, умножаем на коэфициент 80 и получаем количество НСТ-позитивных клеток в 1 микролитре крови. В дальнейшем результаты теста можно представлять как: 1 – количество НСТ-позитивных клеток на 1 микролитр крови. 2 – процент НСТ-позитивных клеток к общему количеству гранулярных лейкоцитов, количество которых предварительно подсчитывается в мазке крови при выполнении общего клинического анализа крови.

Положительный эффект способа перед его аналогами заключается в его простоте и быстроте, так как весь процесс тестирования от момента взятия крови до получения результата не превышает 60 минут. Кроме того, имеет место несомненная экономия на предметных стеклах, фиксаторе и красителе. Замена физиологического раствора хлорида натрия как растворителя НСТ на фосфатносолевой буфер повышает интенсивность отложения гранул формазана в НСТ-позитивных клетках, чем упрощает визуальную дифференцировку и подсчет.

Формула изобретения

Способ проведения экспресс НСТ-теста лейкоцитов периферической крови собак, включающий смешивание крови с растворенным нитросиним тетразолием (НСТ), инкубирование, микроскопирование и подсчет позитивных и негативных клеток, отличающийся тем, что в пробирку вносится и перемешивается 0,05 мл свежей гепаринизированной крови, 0,05 мл 0,2%-ного раствора НСТ на фосфатно-солевом буфере, затем инкубируется в течение 30 мин при Т=37°С, после окончания инкубирования в пробирку вносится 0,3 мл 3,5%-ного раствора уксусной кислоты, тщательно перемешивается, отбирается аликвота полученной смеси и ею заряжается камера Горяева, микроскопируются клетки под увеличением 40×10, при обеспечении минимальной контрастности неокрашенных клеток дифференцированно подсчитываются НСТ-позитивные клетки, содержащие в цитоплазме крови кристаллы формазана, и НСТ-негативные клетки, не содержащие формазан.