Патент на изобретение №2379683

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии. Предложен способ для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота. В крови животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования, определяют коэффициент отношения (К_о) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Способ позволяет повысить достоверность и точность диагностики. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

В Российской Федерации диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими (РИД, ИФА), молекулярно-биологическим (ПЦР), гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, а также биопробой (Методические указания по диагностике лейкоза крупного скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. – 2000 – 13-7-2/2130).

12. – С.8-10).

Существует метод диагностики с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данный метод позволяет обнаружить провирусную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота через 1-2 недели после заражения и определить животных, которые в серологических тестах реагируют отрицательно. Однако метод ПЦР требует дорогостоящего оборудования и используется в России в основном в научных целях.

Для диагностики больных лейкозом животных, а также с целью дифференциальной диагностики форм и стадий болезни, используют гематологический метод исследования. Метод заключается в подсчете количества лейкоцитов в единице объема крови (1 мкл) и качественной оценке лимфоидных элементов – лимфоцитов. Гематологическому исследованию подвергают животных, в сыворотке крови которых серологическим методом обнаружены специфические антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Фазово-контрастным микроскопированием проб крови в камере Горяева дифференцируют лимфоциты от остальных лейкоцитов и получают соответственно показатель абсолютного содержания лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл крови. Эти значения затем оценивают по «лейкозному ключу».

Однако указанный метод и другие методы, предусмотренные методическими указаниями, не предусматривают дифференциацию субпопуляций лимфоцитов, сведение о содержании которых в крови животных позволило бы более точно оценить иммунный статус при лейкозной инфекции крупного рогатого скота.

Задачей изобретения является повышение точности и достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Задача достигается тем, что у РИД-положительных животных проводят забор проб крови, определяют процентное содержание лимфоцитов и процентное содержание Т-лимфоцитов, определяют коэффициент отношения количества лимфоцитов к количеству Т-лимфоцитов (К_о), при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и выводят из стада.

Предложенный способ диагностики отличается тем, что в крови животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, выводят коэффициент отношения (К_о):

Увеличение этого коэффициента указывает на иммунную недостаточность и является наиболее стабильным признаком в иммунной системе у инфицированных или больных лейкозом крупного рогатого скота. Если К_о4,2, то животное считают здоровым, если К_о4,3, то животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию.

Предлагаемый способ диагностики выявляет на 46,6% больше животных больных и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота, является более точным и повышает достоверность.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Анализируют полученные данные таблицы 1 и устанавливают у инфицированных животных по отношению к здоровым достоверное увеличение числа лейкоцитов, В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, распознающих антигены вируса лейкоза крупного рогатого скота. У больных животных по отношению к здоровым устанавливают достоверное увеличение числа лейкоцитов, общего числа лимфоцитов. Содержание В-лимфоцитов у инфицированных коров значительно повышается (Р<0,001), тогда как у больных значительно снижается (Р<0,001). Общим признаком для инфицированных и больных лейкозом крупного рогатого скота устанавливают значительное снижение содержания Т-лимфоцитов (Р<0,001). У таких животных отмечалась либо потеря, либо крайне низкая способность (до 18% у одного животного) образовывать Е-розетки с эритроцитами барана. Таких среди инфицированных коров 90% и среди больных 80%.

Эти результаты согласуются с данными В.Н.Шабалина и Л.Д.Серовой, по мнению которых лимфобласты большинства больных острым лимфобластным лейкозом не образуют Е-розетки (В.Н.Шабалин, Л.Д.Серова. Клиническая иммуногематология. – Л.: Медицина, 1988. – С.171-173). По-видимому, у Т-лимфоцитов, пораженных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, снижается экспрессия рецепторов Т-лимфоцитов к эритроцитам барана, в то же время антитела к вирусу лейкоза и циркулирующие иммунные комплексы блокируют эти рецепторы, что препятствует реакции спонтанного розеткообразования.

Проводят исследования по определению коэффициента отношения процентного содержания лимфоцитов к различным субпопуляциям лимфоцитов (Т-, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, распознающие антигены, и Т-киллеры) для установления наиболее стабильного признака, отражающего иммунный статус животных (таблица 2).

Таблица 2
Коэффициенты отношений лимфоцитов в процентах к субпопуляциям иммунокомпетентных клеток, M±m
Отношение	Здоровые	Инфицированные	P	Больные	P
Лимфоциты/Т-лимфоциты	2,27±0,18	16,59±3,49	<0,01	6,42±0,91	<0,01
Лимфоциты/Т-киллеры	2,53±0,31	2,12±0,29	>0,05	4,15±1,54	>0,05
Лимфоциты/В-лимфоциты	2,50±0,32	1,59±0,14	<0,05	7,48±1,35	<0,01
Лимфоциты/Т-лимфоциты,
распознающие антиген	2,96±0,32	1,81±0,22	<0,01	3,34±0,30	>0,05

Из таблицы 2 видно, что К_о лимфоцитов к Т-киллерам у инфицированных и больных по отношению к здоровым животным не достигает достоверного различия. К_о лимфоцитов к В-лимфоцитам у инфицированных достоверно уменьшается, тогда как у больных увеличивается. К_о лимфоцитов к Т-лимфоцитам, распознающим антигены вируса лейкоза, у инфицированных достоверно уменьшается, а у больных не достигает достоверного различия. Экспериментально установлено, что наиболее стабильным, информативным признаком, отражающим иммунный статус животных, является процентное отношение числа лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов.

Анализируют иммунологические параметры каждого отдельного животного и устанавливают, что отношение лимфоцитов к Т-лимфоцитам среди здоровых не превышает 3,5, среди инфицированных от 4,3 и выше и среди больных варьирует от 4,88 до 16,4.

Например, у больной коровы в крови определено 96% лимфоцитов, методом спонтанного розеткообразования 9% Т-лимфоцитов подставляем полученные данные в формулу

Отношение лимфоцитов к В-лимфоцитам среди здоровых и инфицированных не имеет существенных различий и варьирует от 0,77 до 4,55, в то время как у большинства больных это отношение увеличивается. Отношение лимфоцитов к Т-киллерам и лимфоцитов к Т-лимфоцитам, распознающим антигены вируса лейкоза, среди здоровых, инфицированных и больных животных варьирует в одних пределах и не представляется возможным выделить какой-либо признак различий.

Следовательно, дифференциация субпопуляций лимфоцитов в крови животных позволяет более точно оценить иммунный статус при лейкозной инфекции крупного рогатого скота. Наиболее стабильным признаком в иммунной системе больного и инфицированного лейкозом крупного рогатого скота, свидетельствующим об иммунной недостаточности, является изменение общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов с рецептором к эритроцитам барана, при этом другие иммунологические показатели (число В-лимфоцитов, Т-киллеров и Т-лимфоцитов, распознающих антигены вируса лейкоза) менее информативны и не позволяют с высокой точностью выявить больной или с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупный рогатый скот.

Пример 2. В условиях хозяйства, неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота, исследуют телят, полученных от матерей-вирусоносителей, в возрасте 4-6 месяцев, 12-14 месяцев в сравнении с телятами этих же возрастных групп из благополучного по лейкозу крупного рогатого скота хозяйства (таблица 3). Телята всех возрастных групп не реагировали в РИД. В крови определяют коэффициент отношения процентного содержания лимфоцитов к Т-лимфоцитам.

В возрасте 4-6 месяцев у одного из 15 животных, полученных от матерей-вирусоносителей, К_o=17,0, у остальных – до 3,42. В дальнейшем этих телят подвергли гематологическому методу исследования и выявили того же самого животного, что подтверждает диагноз. У 15 телят из благополучного хозяйства К_o варьировал в пределах от 1,08 до 3,6 и указывал на отсутствие у животных вируса лейкоза.

У 14 животных в возрасте 12-14 месяцев из неблагополучного хозяйства К_o составил от 4,35 и выше (93,3%). Дальнейшее гематологическое исследование позволило выявить 7 больных, из числа 14 животных, у которых K_o составил выше 4,3. У 15 телят этого же возраста из благополучного хозяйства К_o варьировал в пределах от 1,10 до 2,31.

Также исследуют 20 коров, которые содержались в пункте по передержке инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота, заражение которого было выявлено серологически (РИД). К_о содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов у 18 коров составил от 4,31 до 41,5, что свидетельствовало о повышенном риске к заболеванию лейкозом, у 2-х – 2,96 и 2,62 соответственно. В последующем при исследовании гематологическим методом диагноз на лейкоз подтвержден у 11 коров. У 20 коров из благополучного хозяйства это отношение варьировало в пределах от 2,50 до 3,93 (таблица 3).

Из таблицы 3 видно, что в возрастной группе 12-14 месяцев из 15 животных в РИД не выявлено инфицированных животных, гематологическим методом выявлено 7 животных, предлагаемым методом 14 животных, что позволило выявить дополнительно 7 животных (46,66%). Среди 20 коров в РИД выявлено 20 инфицированных животных, гематологическим методом 11, предлагаемым методом – 18, в результате чего выделено 2 (10%) животных, не являющихся инфицированными и гематологически больными, а положительная реакция в РИД, вероятно, связана с неспецифическими реакциями. Таким образом, предлагаемый способ диагностики позволяет дополнительно выявить до 46,66% больных и с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота, является более точным и достоверным.

Формула изобретения

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных и гематологический метод исследования, отличающийся тем, что у инфицированных животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, определяют коэффициент отношения (К_о) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов, при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и выводят из стада.